Expression and structural analysis of a A495K mutant of Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase
| Title: | Expression and structural analysis of a A495K mutant of Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase |
| Author(s): | Fejzullahi, Ardit |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry |
| Degree program: | Master 's Programme in Microbiology and Microbial Biotechnology |
| Specialisation: | no specialization |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2023 |
| Abstract: |
Membraani-pyrofosfataasit (M-PPaasit) katalysoivat pyrofosfaatin käänteisen hydrolyysin epäorgaanisiksi fosfaatti-ioneiksi. Tämä hydrolyysireaktio on kytkettynä protonien ja/tai natriumionien kuljetukseen solukalvon läpi luoden sähkökemiallisen gradientin, jota voidaan käyttää energialähteenä isäntäorganismin toimesta erilaisten stressiolosuhteiden aikana. M-PPaasien fysiologisesti merkittävät toiminnot maatalouden kannalta tärkeissä kasveissa sekä monissa ihmisten taudinaiheuttajissa, kuten Bacteroides fragilis, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii ja Trypanosoma brucei, tekevät niistä tärkeän tutkimuskohteen. Lukuisiin M-PPaaseihin kohdistuneista biokemiallisista tutkimuksista sekä Thermotoga maritima ja Vigna radiata M-PPaasien rakenteiden karakterisoinneista riippumatta, M-PPaasien biokemiasta sekä katalyyttisestä mekanismista on edelleen avoimia kysymyksiä, joista yksi on K+-ioniriippuvuus. Mutaatiotutkimukset ovat viitanneet siihen, että yksi aminohappotähde paikassa 495 on ainoa K+-ioniriippuvuutta määrittelevä tekijä M- PPaaseissa. K+-riippuvaisissa M-PPaaseissa tämä aminohappotähde on alaniini ja sen läheisyyteen sitoutuneella K+-ionilla on todettu olevan tehostava vaikutus K+-riippuvaisissa M-PPaaseissa. Sen on osoitettu kasvattavan pyrofosfaatin hydrolyysireaktion maksimaalista nopeutta. K+-riippumattomissa M-PPaaseissa, paikassa 495 sijaitsee lysiini aminohappotähde, jonka ε-NH3+-ryhmän on rakenteellisten mallinnusten sekä AlaàLys (A495K) mutaatiotutkimusten perusteella ehdotettu jäljittelevän rakenteellisesti ja toiminnallisesti K+ ionin aktivoivaa vaikutusta K+-riippuvaisissa M- PPaaseissa. Antaakseen rakenteellista perustetta tälle väitteelle, tässä tutkimuksessa hypertermofiilisen syvänmeren bakteerin T. maritima M-PPaasi, joka sisältää yhden A495K pistemutaation, tuotettiin Saccharomyces cerevisiae:ssa, liuotettiin korkean lämpötilan (“Hot-solve”) menetelmällä, puhdistettiin metalli affiniteetti kromatografialla ja rakenteellisesti karakterisoitiin röntgenkristallografialla. Niin kuin on ehdotettu, lisätyn lysiinin ε-NH3+-ryhmä todettiin asettuvan samaan kohtaan ja muodostavan samat vuorovaikutukset aktiivisessa keskuksessa kuin K+-ioni K+- riippuvaisissa M-PPaaseissa. Tästä huolimatta nämä rakenteelliset löydökset ovat ristiriidassa tehdyn hydrolyyttisen aktivisuusanalyysin kanssa, josta ilmeni A495K mutaation, K+-riippuvuuden hävittämisen lisäksi, vähentävän kokonaisaktiivisuutta K+ konsentraatiosta riippuen ~2-10-kertaisesti villityyppiin verrattuna. Nämä löydökset viittaavat siihen, että on olemassa jokin muu tekijä (tai muita tekijöitä), 495 aminohappotähteen lisäksi, joka määrittelee K+-ioniriippuvuuden M-PPaaseissa.
Membrane-bound pyrophosphatases (M-PPases) catalyse the reversible hydrolysis of pyrophosphate into two inorganic phosphate molecules. This hydrolysis is coupled to the transport of protons and/or sodium ions across the biological membrane, generating an electrochemical gradient, which can be utilized by the host organism as an energy source under different stress conditions. The essential physiological roles of M-PPases in agriculturally relevant plants and various human pathogens, such as Bacteroides fragilis, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, and Trypanosoma brucei, make them an important research area. Despite the biochemical studies conducted with several M-PPases and structural characterization of Thermotoga maritima and Vigna radiata M-PPases, there remain several questions regarding the biochemistry and catalytic mechanism of M-PPases, one being the basis of K+ dependence. Mutational studies have suggested that a single residue at position 495 is the sole determinant of K+ dependence in M-PPases. In K+-dependent M-PPases this residue is an alanine and a K+ ion binding in close proximity of it, has been shown of having stimulatory effect on K+- dependent M-PPases by increasing the maximal rate of pyrophosphate hydrolysis. In K+-independent M-PPases, a lysine residue resides at 495 position, where the ε-NH3+ group of the lysine residue has been suggested, based on structural modelling and AlaàLys (A495K) mutational studies, to structurally and functionally mimic the activating function of K+ in K+-dependent M-PPases. In order to provide structural basis to this, in this study, a M-PPase belonging to a hyperthermophilic deep- sea bacterium T. maritima containing a single A495K point mutation was expressed in Saccharomyces cerevisiae, solubilized using the high-temperature (“Hot-solve”) method, purified with metal affinity chromatography and structurally characterized using X-ray crystallography. As suggested, the ε-NH3+ group of the introduced lysine was shown to occupy the same space and form the same interactions at the active site as the K+ ion in K+-dependent M-PPases. However, these structural findings were in contradiction with the conducted hydrolytic activity assay which showed that the A495K mutation, besides abolishing K+ dependence, significantly reduced the overall activity compared to the wild type by ~2-10-fold, depending on the K+ concentration. These findings suggest that additional factor(s) besides the 495 residue determine the K+ dependence in M-PPases.
|
| Keyword(s): | Membrane-bound pyrophosphatases Thermotoga maritima ion pumping structural biology |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Fejzullahi_Ardit_thesis_2023.pdf | 10.88Mb |