Infection inhibition and structural characterization of coxsackievirus A9 in complex with compound CL213

Enterovirukset ovat tärkeitä patogeenejä, jotka kuuluvat Picornaviridae-heimoon. Enterovirus-sukuun kuuluu lukuisia tärkeitä ihmisen patogeenejä, kuten poliovirus, enterovirus 71 ja coxsackievirukset. Yhdisteet, jotka sitoutuvat viruksen rakenteeseen ja estävät viruspartikkelin laajenemisen ovat tutkituimpia enterovirusinfektiota vastaan tarkoitettuja antiviraaleja Testasin kahden yhdisteen, CL213:n ja epigallokatekiinigallaatin (EGCG) inhibitorista aktiivisuutta coxsackievirus A9 (CVA9) -infektiota vastaan. Solukulttuureihin perustuvilla menetelmillä määritettiin molempien yhdisteiden inhibitorisen aktiivisuus CVA9-infektiota vastaan. Lisäksi aktiivisemman CL213:n vaikutus CVA9:n lämpöstabiilisuuteen määritettiin. Jotta varmistettaisiin, sitoutuuko yhdiste kapsidiin, viruksen rakenne kompleksissa yhdisteen CL213 kanssa selvitettiin cryo-elektronimikroskopian avulla. Tulokset osoittivat, että CL213 on voimakas CVA9-infektioinhibiittori in vitro ja se lisää viruksen lämpöstabiilisuutta. CVA9:n rakenne kompleksissa CL213:n kanssa selvitettiin 2.5 Ångströmin tarkkuuteen kryoelektronimikroskopialla. Vaikka lämpöstabiilisuustestauksen tulokset viittaavatkin siihen, että yhdiste sitoutuu viruksen rakenteeseen ja viruksen rakenteen ikosaedrisellä rekonstruktiolla (icosahedral reconstruction) oli korkea resoluutio, yhdisteeseen sopivaa tiheyttä (engl. density) ei löydetty viruksen rekonstruktiosta. Tämän vuoksi yhdisteen tarkka toimintamekanismi jää epäselväksi. Yllättävä tulos tutkimuksissa oli se, että EGCG, jonka on aiemmin osoitettu inhiboivan CVA9-infektiota, ei ollut lainkaan aktiivinen näissä antiviraalisen aktiivisuuden määrityksissä. Todennäköisesti ilmiö johtuu siitä, että EGCG:n toiminta perustuu puhdistetun viruksen saostamiseen ja aggregointiin liuoksesta, mutta yhdisteen aktiivisuus katoaa, kun virus on solujen kasvatusliuoksessa. Koska kumpikaan yhdiste ei tulosten perusteella sitoutunut viruksen rakenteeseen, CVA9:n ja enterovirus 71:n VP1 proteiinin hydrofobisten taskujen (engl. VP1-hydrophobic pocket) rakenteita verrattiin, jotta voitaisiin selvittää ovatko yhdisteet, joilla on nanomolaariset IC50 arvot, hyviä lähtökohtia yhdisteiden jatkokehitykselle. Vaikka molempien virusten rakenteista löytyy kyseinen hydrofobinen tasku, suurin osa yhdisteiden sitoutumiseen vaadittavista sivuketjuista eivät ole konservoituneita. Tehokkaiden antiviraalisten yhdisteiden kehitys enterovirusinfektioita vastaan on siis edelleen merkittävä haaste.

Enteroviruses are important pathogens in the family of Picornaviridae. The genus Enterovirus includes multiple important human pathogens such as poliovirus, enterovirus 71 and coxsackieviruses. Compounds binding to the structure of the virus and preventing the expansion of the virus are one of the most studied antivirals against enterovirus infection. I tested the inhibitory activity of two compounds, CL213 and epigallocatechin gallate (EGCG) against coxsackievirus A9 (CVA9) infection. Activity of both compounds against CVA9 infection was evaluated in cell-based assays and the effect of the more active CL213 on the CVA9 thermostability was evaluated. To confirm if the compound binds to the capsid, the structure of the virus in complex with the compound CL213 was solved with cryo-electron microscopy. CL213 was shown to be a potent CVA9 infection inhibitor in vitro and to increase the thermal stability of the virus capsid. The structure of CVA9 in complex with CL213 was reconstructed to 2.5 Ångstrom resolution. Even though the results of thermostability assay suggests that the compound binds to the structure and the reconstruction had high resolution, no corresponding density was found for the compound in the icosahedral reconstruction. Therefore, the mechanism of the action remains inconclusive. Surprising result of the study was that EGCG, which had been previously described to have inhibitory activity against CVA9 infection, was non-functional in the antiviral activity studies described here. This is probably because it works by precipitating purified virus from the solution, but in crude virus preparations, the activity is greatly reduced. As neither compound appeared to bind to the capsid, structural comparison of the VP1 pockets from CVA9 and enterovirus 71 was done to see if the antivirals with nanomolar IC50 values would be good starting for further molecule development. Even though both viruses contain this pocket, the majority of the side chains required for binding were not conserved. The development of potent antiviral compounds for enteroviruses remains unmet challenge.