ABHD16A-proteiinia inhiboivien yhdisteiden toksisuuden tutkiminen hiiren kortikaalihermosoluilla

Alfa-beeta-hydrolyysidomeenin (ABHD) sisältävät proteiinit osallistuvat lipidiaineenvaihduntaan ja sen säätelyyn ihmis- ja eläinsoluissa. Näitä proteiineja on tunnistettu noin 50 ja niiden fysiologisia sekä patofysiologisia toimintoja tutkitaan edelleen. ABHD2, ABHD3, ABHD4, ABHD5, ABHD6, ABHD12 ja ABHD16 osallistuvat glyseriiniesterien sekä fosfolipidien metaboliaan, joista erityisesti lipidivälittäjäaine arakidonyyliglyserolia (2-AG) ja sen metaboliiteilla on endokannabinoidijärjestelmän kautta merkittävä vaikutus hermotulehdukseen. ABHD12 ja ABHD16A olivat tämän tutkielman keskiössä fosfatidyyliseriiniä ja proinflammatorinen lysofosfatidyyliseriiniä säätelevinä entsyymeinä. Tutkimme viiden pontetiaalisen ABHD16A:ta inhiboivan yhdisteen toksisuutta E15/16 ikäisten hiirenalkioiden kortikaalihermosoluilla, tarkoituksena selvittää yhdisteiden soveltuvuus mahdollisia jatkotutkimuksia varten. Kortikaalihermosolut viljeltiin kolmessa erässä yhteensä kahdeksalla 96-kuoppalevyillä ja käsiteltiin samoin kolmessa erässä yhdisteillä. Yhdisteistä käytettiin pitoisuuksia 0,1 µM, 1 µM sekä 10 µM ja viimeisellä toistolla pitoisuuksia 1 µM, 10 µM ja 100 µM. Käsittelyryhmiä muodostui 17 ja jokaisen kuoppalevyjen 60 solullista kuoppaa jaettiin etukäteen sen mukaan suunnitelmallisesti. Tutkittavana määreenä oli elävien kortikaalihermosolujen määrä käsittelyn jälkeen ja niiden laskemiseksi käytimme immunofluoresoivia NeuN- ja DAPI-vasta-aineita. Niiden fluoresenssi kuvattiin automatisoidulla mikroskoopilla ja solujen määrän laskemisessa käytettiin CellProfileria. Aluksi valittujen immunofluoresoivien MAP2-vasta-aineiden avulla solumäärää ei onnistuttu ohjelman avulla laskemaan, joten vaihdoimme vasta-aineita ja saaduista MAP2-värjätyistä kuvista otimme intensiteetin voimakkuuden. Tilastollisen merkitsevyyden arvioimiseksi datalle suoritettiin yksisuuntainen varianssianalyysi ANOVA. Eniten tilastollisesti merkitseviä muutoksia elävien kortikaalihermosolujen määrässä aiheutti yhdiste TAC174, mutta muutokset olivat ristiriitaisesti sekä toksisia että solumäärää lisääviä. Myöskään muiden tilastollisesti merkitsevien tulosten perusteella ei voinut varmasti todeta yhdisteiden TAC121, TAC147 tai TAD40 olevan toksisia, koska tuloksissa esiintyi ristiriitaa ja soluviljelmiin liittyi luotettavuutta heikentäviä tekijöitä. Näiden yhdisteiden tulokset kuitenkin viittaavat enemmän toksisuuteen kuin ei-toksisuuteen Ainoastaan yhdisteen TAC150 tuloksista pystyi olettamaan sen olevan ei-toksinen ainakin pieninä pitoisuuksina, mutta merkitseviä tuloksia ei siitä ei saatu. Tämän lopputuloksen perusteella TAC150 saattaisi soveltua jatkotutkimuksiin, mikäli sen potentiaalia ABHD16A:ta inhiboivana lääkeaineena halutaan tarkemmin selvittää.