C9orf72-ALS-potilaiden indusoiduista monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen liikehermosolujen karakterisaatio
| Title: | C9orf72-ALS-potilaiden indusoiduista monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen liikehermosolujen karakterisaatio |
| Author(s): | Sirjala, Janika |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Genetics and genomics |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2023 |
| Abstract: |
Ihmisen indusoidut monikykyiset kantasolut (hiPS-solut, engl. human induced pluripotent stem cells) ovat aikuisen yksilön erilaistuneista somaattisista soluista takaisin monikykyiseen tilaan ohjelmoituja alkiotyyppisiä soluja. Monikykyiset kantasolut voidaan erilaistaa lähes miksi tahansa solutyypiksi käyttäen kohdennettuja erilaistusmenetelmiä, joiden tehokkuus kuitenkin vaihtelee solutyypin mukaan. Indusoituja kantasoluja ja niistä erilaistettuja soluja voidaan käyttää tautimallina, joka mallintaa myös yksilön feno- ja genotyyppejä. Amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS, engl. Amyotrophic lateral sclerosis) on etenevä liikehermosolujen rappeumatauti, jossa alemmat ja ylemmät liikehermosolut menettävät toimintakykynsä halvauttaen potilaan. ALS:iin ei ole parantavaa hoitokeinoa ja elinajanodote sairastuneella on 3–5 vuotta ensimmäisten oireiden alkamisesta. Yleisin perinnölliseen ALS-patologiaan yhdistetty mutaatio on kuuden nukleotidin pituinen toistojaksopidentymä geenissä C9orf72. ALS:n patologiaan on yhtenä tekijänä liitetty solun tasapainon häiriötila solulimakalvoston (ER, engl. endoplasmic reticulum) stressi, joka pitkittyneenä johtaa ohjelmoituun solukuolemaan.
Tämän tutkielman ensisijaisena tarkoituksena on karakterisoida neljän kantasolulinjan erilaistus alemmiksi liikehermosoluiksi. Lisäksi on tarkoitus selvittää aivoperäisen hermokasvutekijän (CDNF, engl. cerebral dopamine neurotrophic factor) ja siitä johdetun peptidin hermosoluja suojaavaa vaikutusta tapsigargiini (TG) -indusoituun ER-stressiin sekä solujen viabiliteettiin. Työssä käytettiin yhteensä neljää eri solulinjaa, kahta hiPS-kontrollisolulinjaa terveiltä yksilöiltä sekä kahta hiPS-potilaslinjaa C9orf72-toistojakson pidentymää kantavilta ALS-potilailta. Erilaistuksen tehokkuutta arvioitiin käyttäen molekulaarisia markkereita monikykyisille kantasoluille sekä alempien liikehermosolujen eri kehitysvaiheille. Erilaistuksen erivaiheisista soluista viikoittain kerätyistä näytteistä mitattiin relatiiviset geeniekspressiotasot kvantitatiivisella PCR:llä. Erilaistuksen aikana soluille tehtiin myös immunosytokemiallisia vasta-ainevärjäyksiä liikehermosolujen tunnistamiseksi. Lisäksi työssä mitattiin erilaistuvien liikehermosolujen endogeenisen CDNF:n ekspressiotasot erilaistuksen eri vaiheissa sekä analysoitiin CDNF:n vaikutuksia TG-indusoituun ER-stressiin liikehermosoluissa. Myös solujen viabiliteetti analysoitiin kasvutekijä-TG-käsittelyissä.
Erilaistetuissa liikehermosoluissa kypsien liikehermosolujen markkerien ekspressiotasot nousivat sekä monikykyisten kantasolujen tai hermosolujen esiasteiden markkerit laskivat. Erilaistuneet liikehermosolut ekspressoivat liikehermosolujen markkereita myös proteiinitasolla kaikilla solulinjoilla. CDNF ekspressoitui korkeimmillaan esiastesoluissa. ER-stressin vasteessa tapsigargiinille ei havaittu eroja eri käsittelyjen välillä, ER-stressin vaste kuitenkin kasvoi TG-käsitellyissä soluissa. Käsittelyt vaikuttivat eri tavalla kontrolli- ja potilaslinjojen viabiliteettiin. Kontrollisolulinjoilla viabiliteetti laski käsittelyjen myötä, kun taas potilassolulinjoilla käsittelyt paransivat viabiliteettia.
Monikykyisten kantasolujen erilaistus liikehermosoluiksi onnistui ja solut tunnistettiin liikehermosoluiksi useilla molekyylimarkkereilla. Solujen erilaistus neljällä solulinjalla toistettiin kahdesti, ja tulokset vastasivat hyvin toisiaan. Endogeenisen CDNF:n ekspressio mitattiin ensimmäistä kertaa hiPS-liikehermosoluista ja niiden esiasteista. Tässä koeasetelmassa CDNF tai siitä johdettu peptidi ei vähentänyt ER-stressiä, mutta sillä oli vaikutus erityisesti potilaslinjojen viabiliteettiin kasvutekijäkäsittelyn yhteydessä.
Tulevissa kokeissa TG-käsittelyä voidaan optimoida ajoituksen ja kasvutekijöiden annostelun suhteen, tai toksiini voidaan vaihtaa toiseen ER-stressiä indusoivaan toksiiniin. Lisäksi C9orf72-patologia tulisi tunnistaa erilaistetuissa liikehermosoluissa, jotta niitä voidaan käyttää jatkossa prekliinisenä tutkimusmallina.
Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are derived from adult differentiated somatic cells and reprogrammed to an embryonic-like state. Pluripotent stem cells can be differentiated into almost any somatic cell type by using directed differentiation methods, but the differentiation efficiency often varies depending on the cell type. hiPSCs and cells differentiated from them can be used as a disease model carrying the patient’s phenotype and genotype. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive motor neuron disease where both upper and lower motor neurons degenerate, leading to paralysis. There is no curative treatment for ALS, and it leads to the death of the patient in 3 to 5 years on average from the first symptoms. The most common genetic cause of familial ALS is a hexanucleotide repeat expansion in C9orf72-gene. ALS pathology is strongly linked to endoplasmic reticulum (ER) stress, which affects cell homeostasis and proteostasis, and leads to apoptosis when prolonged.
The primary aim of this research is to characterize the differentiation of four hiPSCs lines towards lower motor neurons and to study the neuroprotective effects of cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and CDNF-derived peptide on ER stress and cell viability. This experiment used two control cell lines from two healthy donors and two patient cell lines from two different ALS patients carrying the C9orf72-mutation. To evaluate the efficiency of the differentiation towards motor neurons, molecular markers for pluripotent and neural progenitor cells as well as for maturated motor neurons were analyzed. Relative gene expression levels were measured from weekly time points with qPCR. Immunocytochemical (ICC) antibody staining was performed during differentiation. Endogenic CDNF levels were analyzed from differentiating cells at weekly time points and the effect of CDNF on Thapsigargin (TG) -induced ER stress in motor neurons was analyzed. In addition, cell viability was analyzed in TG-CDNF treatment.
All pluripotent and progenitor markers were downregulated in differentiated cells, and the expression of the mature motor neuron markers was upregulated. Mature motor neuron markers were also expressed at the protein level. The endogenous CDNF levels were highest at the progenitor cell stage. The ER stress response was upregulated in TG-treated cells, and there were no differences between treatments against ER stress. Furthermore, TG and growth factor treatments differentially affected the viability of the control and patient cell lines. Treatment decreased viability in control cell lines and increased viability in patient cell lines.
Pluripotent stem cells were successfully differentiated toward motor neurons. The differentiation was performed twice, and the results were similar on both individual biological repeats. Analysis of endogenous CDNF expression levels was performed for the first time on hiPSCs lines. In this study, CDNF or its derivate didn’t reduce ER stress but it influenced cell viability, especially in patient cell lines with growth factor treatment.
In the future, TG-treatment could be optimized regarding timing and growth factor treatment, or the toxin could be changed to another ER-stress inducing toxin. In addition, the C9orf72 pathology should be identified in order to use differentiated motor neurons as a pre-clinical disease model.
|
| Keyword(s): | indusoidut pluripotentit kantasolut hiPSC ALS C9orf72 CDNF ER stressi |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Sirjala_Janika_maisterin tutkielma_2023.pdf | 2.840Mb |