Functional quantification of DNA mismatch repair gene variant pathogenicities from suspected LS individuals
| Title: | Functional quantification of DNA mismatch repair gene variant pathogenicities from suspected LS individuals |
| Author(s): | Kuivala, Tea |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences |
| Degree program: | Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences |
| Specialisation: | Molecular and Analytical Health Biosciences |
| Language: | English |
| Acceptance year: | 2023 |
| Abstract: |
Lynchin syndrooma (LS) on yleisin perinnöllinen syöpäalttius, jonka aiheuttaa vallitsevasti peritty taudinaiheuttava perimän muutos eli patogeeninen variantti (PV) emäspariutuma- ja kahdentumisvirheiden korjaukseen (engl. mismatch repair, MMR) osallistuvasta geenistä. MMR-mekanismi korjaa muun muassa DNA:n kahdentumisessa tapahtuvia virheitä pääasiassa neljän MMR-proteiinin – MSH2, MSH6, MLH1 ja PMS2 – avulla. Perinnöllinen PV altistaa syövälle vioittuneen geenialleelin ollessa läsnä jokaisessa somaattisessa solussa, jolloin syöpään johtavan kehityskulun aloittamiseksi saattaa riittää vain toisen geenialleelin menetys somaattisen mutaation kautta Knudsonin ”kahden iskun” hypoteesin mukaisesti. Alleelien menetys johtaa MMR-proteiinin toiminnan heikkenemiseen, jota kautta koko korjausmekanismi kärsii. Kun virheet jäävät korjaamatta, perimästä tulee epävakaa vaurioiden kumuloituessa. LS lisää erityisesti paksusuolisyövän ja kohdunkaulan syövän riskiä. Perinnöllinen syöpäalttius, eli LS, on tärkeä tunnistaa mahdollisimman varhaisessa vaiheessa, jotta riskiä syövän kehittymiselle voidaan madaltaa seurannalla ja ennaltaehkäisyllä. MMR-geenit ja niiden variantit eroavat suuresti vaikutukseltaan korjausprosessille, joten on tärkeää ottaa kyseiset ominaispiirteet huomioon esimerkiksi syöpäriskin suuruutta arvioitaessa. Variantit, joiden merkitystä syöpäalttiudelle ei tiedetä tarkasti (VUS, engl. variant of uncertain significance), ovat hyvin yleisiä. Tällaisista varianteista voidaan saada lisää tietoa muun muassa in vitro- ja in silico-menetelmien avulla. Syöpäalttiuden varhaiseen havainnointiin ja sairauden ennaltaehkäisyyn tähtäävän toiminnan tärkein tavoite on siten vähentää syöpää sairastavien ja siihen kuolevien määrää.
Tässä tutkielmassa tutkittiin MSH2- ja MSH6-korjausgeenien varianttien patogeenisuuksia kyseisten geenien proteiinituotteille kehitetyn toiminnallisen in vitro -testin, DiagMMR:n, avulla. Perinteisen agaroosigeelielektroforeesin (AGE) lisäksi näytteet analysoitiin fragmenttianalyysiin tarkoitetulla kapillaarielektroforeesilaitteella, Labchipillä, jotta menetelmiä voitiin verrata. Tutkimuksessa käytettiin Helsingin ja Uudenmaan sairaanhoitopiirin (HUS) keräämiä ihokoepaloja kontrolleilta ja LS-potilailta, joiden kantama geenimuutos oli selvitetty sekvensoinnilla. InSiGHT-tietokannan, johon eri MMR-geenien variantit sekä niille näytön perusteella annetut patogeenisuusluokitukset on kerätty, perusteella tutkimukseen valittiin sekä kansainvälisesti listaamattomia että patogeenisia (luokka 5) variantteja erilaisten variaatioiden tutkimisen varmistamiseksi. Koepaloista kasvatettiin fibroblasteja tumaproteiinien, joihin myös MMR-proteiinit lukeutuvat, eristämiseksi. Eri varianttien patogeenisuus määritettiin tutkimalla MMR-proteiinien toiminnan tehokkuutta, kun tumaproteiiniuutteeseen lisättiin emäspariutumavirheen omaavaa heterodupleksisubstraatti-DNA:ta. Katkaisuentsyymien avulla saatiin tuotettua erikokoisia substraattikappaleita, riippuen MMR-proteiinien korjausaktiivisuudesta, joiden määrää ja suhdetta toisiinsa havainnoitiin elektroforeettisin menetelmin. Lisäksi MAPP-MMR -menetelmää hyödynnettiin MSH2 mismatch-varianttien tutkimiseen in silico.
Kahden menetelmän tuloksia vertaamalla voitiin havaita kvantitatiivisemman Lapchipin tuovan diagnostista lisäarvoa testille antaen näyttöä jopa 100 %:n spesifisyydestä (n=10) ja 90,9 %:n sensitiivisyydestä (n=11) verrattuna variaatiotietoihin. Esimerkiksi InSiGHT:issa patogeeniseksi luokiteltu MSH6 c.3103C>T nähtiin toistuvasti korjausmekanismin heikentymänä (dMMR, engl. MMR deficiency) jokaisen sitä kantavan potilaan kohdalla Labchip-menetelmällä analysoituna. Tutkitut menetelmät erosivat toisistaan erityisesti MSH6-varianttien detektiossa mutta vähemmän, kun Labchip-tuloksia verrattiin aiempiin, validoidun DiagMMR-protokollan pohjalta saatuihin, tulkintoihin. Toistaiseksi listaamattomista c.3139dupT ja c.551delA MSH6-varianteista saatiin tutkimuksessa lisätietoa, joista ensimmäinen antoi Labchipillä analysoituna toistettavasti dMMR-tuloksen ja oli yhteneväinen aiemman tulkinnan kanssa. Jälkimmäinen antoi normaalin (pMMR, engl. MMR proficient) tulkinnan kaikissa analyyseissä aiemman tulkinnan ollessa epäselvä, mikä osoittaa lisätestien tarpeellisuuden tälle variantille. Myös MSH2 varianteista yksi oli listaamaton (c.1805T>C), joka nähtiin toistuvana dMMR-tuloksena kahdella potilaalla. Lisäksi MAPP-MMR:llä saatiin korkea tulos (25.150) variantista seuraavalle p.Leu603Pro aminohappomuutokselle, mikä tukee kyseiselle variantille saatuja testituloksia sen patogeenisuudesta. DiagMMR- testiä voidaankin käyttää luotettavasti, erityisesti kvantitatiivisemman analyysimetodin avulla, MMR-mekanismin toiminnan tutkimiseen.
Lynch syndrome (LS) is the most common cancer predisposition disease caused by dominantly inherited pathogenic variant (PV) of a mismatch repair (MMR) gene leading to a defective gene allele. The four major MMR genes encode MMR proteins – MSH2, MSH6, MLH1 ja PMS2 – that participate in the proofreading and repairing of the daughter strand for mismatches after every replication. The inherited PVs predispose to cancer development as only one somatic allele loss is required for biallelic loss according to the Knudson’s “two-hit” hypothesis. The biallelic loss of an MMR-gene leads to disrupted protein function altering the MMR process. When mismatches are left unrepaired, genomic instability is caused, which can eventually lead to tumorigenesis. Especially, the risk of colorectal cancer (CRC) and endometrial cancer (EC) is increased in LS. The predisposition syndrome, LS, is important to detect as early as possible to decrease the risk of cancer by prevention and surveillance. The MMR genes and their defects vary in their consequences to the repair process considerably, and thus, it is crucial to know the different characteristics and functional effects of them when estimating the level of cancer risk. Variants of uncertain significance (VUS) are especially prevalent among LS variants. More information about their impact to the disease can be acquired by in vitro and in silico methods, for instance. The main goal of the efforts for early detection and prevention is to reduce cancer morbidity and mortality.
In this thesis, the pathogenicities of MSH2 and MSH6 variants were studied with DiagMMR assay, which has been developed for studying the protein function of these genes. In addition to the traditional agarose gel electrophoresis (AGE), the samples were also analyzed by a fragment analyzer, Labchip, that bases its function on capillary electrophoresis. This way the MMR detection efficiency of the methods could be compared. Samples were collected as skin biopsies from controls and LS patients with known MMR gene variants by Helsinki University Central Hospital (HUCH). InSiGHT database, that collects the different MMR-gene variants and their pathogenicity classification, was used to ensure that different kinds of variations, both pathogenic (class 5) and currently internationally unlisted variants, were analysed. The skin samples were cultured to acquire primary fibroblasts for nuclear protein extraction. The level of pathogenicity was revealed by MMR-protein activity when substrate DNA with a mismatch was added to the extract. Then, restriction enzymes were used for producing fragments of different lengths, depending on the repair action, and the MMR efficiency was visualized by both electrophoretic methods. Additionally, MAPP-MMR tool was used for studying the MSH2 mismatch variants in silico.
By comparing the results from these two methods, we show that the more quantitative Labchip brings diagnostic value to DiagMMR suggesting 100% specificity (n=10) and 90,9% (n=11) sensitivity in reference to the variant information. For example, MSH6 c.3103C>T, which is listed as pathogenic in InSiGHT, was more consistent in giving a MMR deficient (dMMR) result with Labchip. Difference in the functional detection could be seen particularly with the MSH6 variants, but the differences were less notable when Labchip results were compared to the previous interpretations of the samples made based on the validated DiagMMR protocol. With the unlisted MSH6 variants, c.3139dupT was detected as dMMR by Labchip which was in unison with the previous interpretation. Another one, MSH6 c.551delA, was seen as MMR proficient (pMMR) in all the results by both the methods, and with the previous interpretation being unclear, which highlights the importance of further testing of this variant. There was also one unlisted variant (c.1805T>C) among MSH2 for which we got uniform dMMR results in two patients. The high MAPP-MMR score (25.150) for the MSH2 p.Leu602Pro amino acid change also supported the evidence gained of the pathogenic nature of this variant. As a conclusion, DiagMMR can be used reliably for MMR efficiency analysis, especially when performed together with a more quantitative analysis method.
|
| Keyword(s): | Lynch syndrome mismatch repair pathogenic variant DiagMMR Labchip |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| Kuivala_Tea_thesis_2023.pdf | 1.331Mb |