Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Evaluation of real-time RT-PCR for diagnostic use in detection of Puumala virus

Show full item record

Title: Evaluation of real-time RT-PCR for diagnostic use in detection of Puumala virus
Author(s): Niskanen, Silja; Jääskeläinen, Anne; Sironen, Tarja; Vapalahti, Olli
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Medicine
Discipline: Virology
Language: English
Acceptance year: 2016
Abstract:
Myyräkuume on Puumala-viruksen aiheuttama munuaisoireinen verenvuotokuume, jonka oirekuva vaihtelee lievästä vakavaan. Puumala-virus kuuluu jyrsijöiden, hyönteissyöjien ja lepakoiden levittämiin hantaviruksiin, jotka aiheuttavat munuaisoireista verenvuotokuumetta Euroopassa ja Aasiassa ja hantavirus-sydän-keuhko-oireyhtymää Amerikan mantereella. Puumala on Euroopan yleisin hantavirus ja sitä tavataan Pohjois-, Keski- ja Itä-Euroopassa ja Venäjällä. Sen kantajana toimii metsämyyrä (Myodes glareolus), jonka kannan vaihteluita myyräkuumeinsidenssi seuraa ollen noin 560–3800 vuosittain. Suomalaisista noin 5 % on Puumala-seropositiivisia, joskin luku on jopa 11 % Itä-Suomessa. Myyräkuumeen itämisaika on noin kahdesta neljään viikkoa. Tauti alkaa äkillisesti kuumeella ja päänsäryllä, joita seuraavat vatsa- ja selkäkivut, pahoinvointi ja oliguria. Taudin alussa noin kolmasosalla esiintyy myopiaa, joka on patognomonista myyräkuumeelle. Verenkuvassa näkyvät kohonnut CRP ja leukosyytit sekä trombosytopenia. 0,1 % potilaista menehtyy ja kuolinsyynä on useimmiten verenvuotoshokki tai aivolisäkkeen verenvuoto. 5 % potilaista päätyy dialyysiin ja jotkut kärsivät useamman vuoden ajan taudin sairastamisen jälkeen kohonneista verenpainearvoista. Myyräkuumeen laboratoriodiagnostiikka perustuu tällä hetkellä IgM-luokan vasta-aineiden osoittamiseen verestä. Potilaat serokonvertoituvat jo taudin ensimmäisinä päivänä, joten serologia on varsin käyttökelpoinen diagnostisena menetelmänä. Halusimme kuitenkin selvittää, onko myyräkuumetta mahdollista diagnosoida reaaliaikaisella PCR-testillä, joka osoittaisi Puumala-viruksen RNA:ta ja viremian potilaan verestä jo aivan taudin alkuvaiheessa. Keräsimme yhteensä 238 seeruminäytettä, jotka oli lähetetty HUSLAB-laboratorioon eri sairaaloista ja terveyskeskuksista rutiininomaista myyräkuumediagnostiikkaa varten. Lisäksi tutkittiin muille hantaviruksille positiiviset näytteet (Saaremaa, Tula, Tobografov, Dobrava ja Hantaan) sekä 20 negatiivista kontrollinäytettä. Näytteet tutkittiin rutiininomaisen IgM-testin lisäksi sekä kehittämällämme reaaliaikaisella qRT-PCR-menetelmällä (PUUV-qRT-PCR) että kaksivaiheisella RT-nested-PCR-menetelmällä, josta positiiviset näytteet lähetettiin eteenpäin sekvensoitaviksi. qRT-PCR-menetelmässä standardinäytteenä toimi Sotkamo-kannan RNA:n S-juoste. Diagnostiikassa positiivisiksi osoittautui 31 näytettä. Näistä 30 oli positiivisia serologisella menetelmällä. Yksi näyte jäi siis positiiviseksi ainoastaan PUUV-qRT-PCR:ssä. 30 IgM-positiivisesta näytteestä 28 oli positiivisia PUUV-qRT-PCR-menetelmällä. Diagnostinen sensitiivisyys oli 93.3% (95% CI: 77.93%-99.18%). Tutkimme positiivisen näytteen antaneiden potilaiden tiedot HUSLAB:n potilastietokannasta. Kävi ilmi, että vasta-ainenegatiivisesta, PUUV-qRT-PCR-positiivisen näytteen antaneesta potilaasta oli otettu näyte jo aivan taudin alkuvaiheissa, jolloin viremia on korkealla tasolla, mutta IgM-luokan vasta-aineet eivät ole vielä nousseet. Kyseisestä potilaasta otettiin vielä myöhemmin toinen näyte, joka oli positiivinen sekä IgM-testillä että PUUV-qRT-PCR-menetelmällä. Kaksi PUUV-qRT-PCR-menetelmällä negatiiviseksi jäänyttä IgM-positiivista potilasta oli puolestaan tutkittu 1-2 viikkoa oireiden alusta, jolloin viremia oli jo näin ollen ehtinyt laskea. Kaksivaiheisella RT-nested-PCR-menetelmällä tutkittuna 25 näytteestä oli osoitettavissa Puumala-viruksen RNA:ta. Nämä näytteet sekvensoitiin ja kannat järjestettiin fylogeeniseen puuhun eri suomalaisten kantojen oheen, mikä osoitti PCR-menetelmän löytävän varsin laajasti suomalaisia Puumala-viruskantoja. Negatiiviset kontrollinäytteet ja muille hantaviruksille positiiviset näytteet jäivät PCR-menetelmillä negatiivisiksi, joten menetelmän spesifisyys oli 100 %. Reaaliaikainen qRT-PCR-testi osoittautui sekä herkäksi että tarkaksi ja voisi toimia diagnostiikassa täydentävänä tutkimuksena serologisten menetelmien ohella. Se voisi joissain tapauksissa osittaa taudin jo ennen vasta-aineiden ilmaantumista. Haasteita viruksen RNA:n osoittamiselle diagnostiikassa asettaa Puumalan varsin suuri geneettinen varianssi. Todennäköisesti testimme on varsin spesifinen suomalaisille kannoille, mutta tutkimuksia erilaisilla Puumala-kannoilla tarvitaan vielä. Vastaavia tuloksia on saatu kahdessa ruotsalaistutkimuksessa, jossa reaaliaikainen PCR-testi osoittautui herkäksi ja tarkaksi, mutta varsin spesifiseksi ruotsalaisille kannoille.
Keyword(s): Real-time qRT-PCR Nephropathia Epidemica Puumala virus


Files in this item

Files Size Format View
Artikkeli-tiivistelmä-Silja.pdf 712.1Kb PDF

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record