Geenin CBO0224 koodaaman σ54-faktorin merkitys Clostridium botulinum ATCC 3502 -kannan fysiologiassa ja stressivasteessa
| Title: | Geenin CBO0224 koodaaman σ54-faktorin merkitys Clostridium botulinum ATCC 3502 -kannan fysiologiassa ja stressivasteessa |
| Author(s): | Joutsen, Suvi |
| Contributor: | University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Food and Environmental Hygiene |
| Discipline: | Food Hygiene |
| Language: | Finnish |
| Acceptance year: | 2007 |
| Abstract: |
Clostridium botulinum is an obligatory anaerobic, gram-positive and spore-forming food-borne pathogen. It produces one of the most toxic substances known, botulinum neurotoxin. Botulinum toxin causes a rare but life-threatening illness called botulism. The significance of botulism may grow in the future with the development of the modern food industry.
C. botulinum strains form four physiologically distinct groups (I-IV). The four groups are diverse, as for example the group I spores have a high heat resistance, while group II strains are capable of growing in refridgerated temperatures. Toxins from the groups I and II are human pathogens, while toxins produced by group III strains are pathogenic only to animals. There are seven distinct serotypes of botulinum toxins, and these are marked with letters A-G. Inhibition of neurotransmitter acetylcholine release caused by botulinum toxin causes paralysis.
All bacteria have sigma factors, which are an important part of transcription initiation mechanism. Sigma factors are components of the RNA polymerase holoenzymes. These are involved in recognizing specific promoters, and by binding to different promoters they enable the initiation of transcription. Bacteria have many different sigma factors that are divided into two classes: in first class there are house-keeping σ70-factors and stress-activated alternative sigma factors and in the second class σ54-factors, which are involved in nitrogen metabolism and stress tolerance. Only little research has been done on C. botulinum sigma factors and there is, for example, no knowledge of their heat and cold resistance.
In this research we studied the importance of σ54-factor in the colony morphology, metabolism and heat and cold resistance of C. botulinum ATCC 3502. A deletion mutant for the gene CBO0224 of C. botulinum was constructed with ClosTron technique, in which a target-specified group II intron is inserted into the genome. After activation, the intron interrupts the gene and inhibits transcription. The mutant strain was compared to the wild type by growing it on blood and egg yolk agar plates, on which it grew slower and the colonies were smaller. The metabolism of the mutant was studied with API-test, in which the mutant did not show any sign of fermentation of glucose, maltose, salicin or trehalose, or hydrolysis of esculin or utilization of urea. The mutant was also compared to the wild type by growing both strains at different temperatures, at 15°C and 20°C, at the optimum temperature of 37°C and at 45°C. The mutant grew slower than the wild type at all studied temperatures.
The σ54-factor of C. botulinum strain ATCC 3502 has a clearly influence on the bacterium's capability of growing both in an optimal and a stressful environment. In this research the first genetically modified strain of the σ54-factor of C. botulinum ATCC 3502 strain was constructed to produce information on the sigma factor's importance to the metabolism and stress resistance of the bacterium.
Clostridium botulinum on obligatorisesti anaerobinen, gram-positiivinen ja kestäviä itiöitä muodostava elintarvikepatogeeni, joka tuottaa yhtä maailman myrkyllisimmistä toksiineista, botulinumneurotoksiinia. Botulinumtoksiini aiheuttaa harvinaista, mutta vakavaa botulismi-nimistä sairautta, jonka merkitys voi kasvaa nykyaikaisen teollisen elintarviketuotannon kehittyessä.
C. botulinum -kannat jaetaan neljään eri ryhmään (I-IV) fysiologisten ominaisuuksiensa perusteella. Ryhmät eroavat toisistaan melko paljon, esimerkiksi ryhmän I itiöt kestävät korkeitakin lämpötiloja, kun taas ryhmän II kantojen on todettu voivan lisääntyä jääkaappilämpötiloissakin. Ryhmien I ja II erittämät toksiinityypit ovat ihmiselle vaarallisia, kun taas ryhmä III aiheuttaa botulismia eläimille. Botulinumtoksiini on olemassa seitsemää eri serotyyppiä, joita merkitään kirjaimilla A-G. Botulinumtoksiini on hengenvaarallista sekä ihmisille että eläimille estäessään hermolihasliitoksessa asetyylikoliinivesikkeleiden fuusioitumisen solukalvoon ja näin impulssin etenemisen.
Kaikilla bakteereilla sigmafaktorit ovat tärkeä solun transkriptiojärjestelmän osa, joka säätelee osittain geenien transkription alkamista. Sigmafaktorit ovat RNA-polymeraasiin liittyvä osa, joka tunnistaa itselleen spesifisen osan geenin promoottorista, tarttuu tähän osaan kiinni ja mahdollistaa transkription alkamisen. Sigmafaktoreita on bakteereilla useita erilaisia ja ne jakaantuvat kahteen luokkaan, solun normaaleihin toimintoihin liittyviin σ70-faktoreihin ja stressitilanteissa aktivoituviin vaihtoehtoisiin sigmafaktoreihin sekä σ54-faktoreihin, joiden tehtävät liittyvät niin normaalikasvuun liittyvään typen metaboliaan kuin erilaisista stressitilanteista selviämiseen. C. botulinum -kantojen sigmafaktoreita on tutkittu hyvin vähän ja esimerkiksi niiden merkityksestä bakteerin kylmän- ja kuumansiedossa ei tiedetä mitään.
Tässä tutkimuksessa selvitettiin C. botulinum ATCC 3502 -kannan σ54-faktorin merkitystä bakteerin pesäkemorfologiassa, metaboliassa ja kylmän- ja kuumansiedossa. Tutkimusta varten luotiin σ54-faktoria koodaavan geenin suhteen geneettisesti muunneltu kanta ClosTron-tekniikalla, jossa muunneltavan bakteerin genomiin siirretään spesifisesti vaiennettavalle geenille kohdennettu ryhmän II introni, joka aktivoiduttuaan häiritsee kohdegeenin lukukehystä ja estää näin σ54-faktorin tuottamisen. Geneettisesti muunneltua kantaa vertailtiin villityyppiin pesäkemorfologian suhteen kasvattamalla sitä erilaisilla veri- ja kananmunankeltuaisagarlevyillä, joilla se kasvoi selvästi hitaammin ja pistemäisempinä pesäkkeinä kuin villityyppi. Metaboliaa tutkittiin API-testillä, jossa muunneltu kanta erosi villityypistä glukoosin, maltoosin, salisiinin ja trehaloosin fermentaation, eskuliinin hydrolyysin sekä ureaasin puuttumisella. Kasvukokeissa muunneltu kanta kasvoi villityyppiä huonommin ja hitaammin tutkituissa lämpötiloissa 15, 20, optimilämpötila 37 ja 45 °C:ssa.
C. botulinum ATCC 3502 -kannan σ54-faktori vaikuttaa selvästi bakteerin kykyyn selvitä sekä optimaalisissa että lämpötilaltaan stressaavissa olosuhteissa. Tutkimuksessa luotiin ensimmäinen σ54-faktorin suhteen geneettisesti muunneltu C. botulinum ATCC 3502 –kanta, joka antoi tietoa kyseisen sigmafaktorin merkityksestä bakteerin metabolialle ja stressivasteelle.
|
| Keyword(s): | ATCC 3502 ClosTron sigmafaktorit σ54-faktori geenimuuntelu stressivaste Clostridium botulinum geenitekniikka stressi |
Files in this item
| Files | Size | Format | View |
|---|---|---|---|
| JoutsenS-tiivistelmat.pdf | 22.97Kb |