Browsing by Subject "Immunohistochemistry"

Immunohistochemistry (IHC) is a widely used research tool for detecting antigens and can be used in medical and biochemical research. The co-localization of two separate proteins is sometimes crucial for analysis, requiring a double staining. This comes with a number of challenges since staining results depend on the pre-treatment of samples, host-species where the antibody was raised and spectral differentiation of the two proteins. In this study, the proteins GABAR-α2 and CAMKII were stained simultaneously to study the expression of the GABA receptor in hippocampal pyramidal cells. This was performed in PGC-1α transgenic mice, possibly expressing GABAR-α2 excessively compared to wildtype mice. Staining optimization was performed regarding primary and secondary antibody concentration, section thickness, antigen retrieval and detergent. Double staining was performed successfully and proteins of interest were visualized using a confocal microscope after which image analyses were performed using two different methods: 1) a traditional image analysis based on intensity and density of stained dots and 2) a novel convolutional neural network (CNN) machine learning approach. The traditional image analysis did not detect any differences in the stained brain slices, whereas the CNN model showed an accuracy of 72% in categorizing the images correctly as transgenic/wildtype brain slices. The results from the CNN model imply that GABAR-α2 is expressed differently in PGC-1α transgenic mice, which might impact other factors such as behaviour and learning. This protocol and the novel method of using CNN as an image analysis tool can be of future help when performing IHC analysis on brain neuronal studies.

The degree of neurogenesis in the adult hippocampal dentate gyrus (DG) is the center of the discussion in the field of adult neurogenesis. Although there is an on-going controversy, accumulating evidence suggests that the neural stem cells (NSCs) in the adult human DG are very few. The question remains open as to why there are so few NSCs in the adult human DG when compared with the rodent DG. In order to address these questions, it seems necessary to understand the developmental process of the NSCs in the adult human DG. In this thesis, the neural stem and progenitor cells in the fetal human DG are characterized. In addition to these findings, a semi-automatic method for counting and categorizing cells in their expressions of immunochemistry markers is developed.

Digitaalisella analyysillä tarkoitan tässä yhteydessä kudosnäytteiden analysoimista tietokoneavusteisesti: immunohistologisesti värjätty näytelasi skannataan ja tiedosto avataan tietokoneelle ladatussa ohjelmistossa, jossa se analysoidaan. Ohjelma tunnistaa soluja sekä värisävyeroja. Tutkijat haluavat mennä kohti digitaalista analyysia, koska sen uskotaan olevan objektiivisempaa ja tehokkaampaa kuin manuaalisen visuaalisen analyysin, varsinkin suurien aineistojen kohdalla. Tutkimuksessa selvitin immunohistologisten näytteiden digitaalisen analysoinnin nykytilaa ja mahdollisuuksia tulevaisuudessa. Tavoitteenani oli saada kuva digitaalisen analysoinnin käytöstä, ja kirjallisuuskatsauksen sekä haastattelujen perusteella valita analysointiohjelmisto suupatologian tutkimusryhmän käyttöön. Tutkimuksessa haastattelin tutkijoita Oulun ja Helsingin yliopistoista, osallistuin aihetta käsitelleeseen kahteen seminaariin, laadin kirjallisuuskatsauksen sekä perehdyin ohjelmistojen käyttöön. Ohjelmistojen käyttö on kansainvälisesti laajaa, ja tutkijakunnassa suositaan kaupallisten ohjelmien sijaan nk. open-source ilmaisohjelmistoja, kuten ImageJtä, CellProfileriä tai Icyä. Haastattelujen ja kirjallisuuskatsauksen perusteella valikoin testikäyttöön QuPath-ohjelmiston. Testasin ohjelmiston toimivuutta vertaamalla digitaalista analyysia tutkijoiden silmämääräisesti tekemään immunohistologiseen analyysiin kymmenestä kielisyöpänäytteestä. Tein ohjelmalle seikkaperäiset analysointiohjeet suomeksi ja englanniksi. Kolme tutkijaa käytti ohjeideni mukaan ohjelmaa ja antoi siitä kommenttinsa. Ohjelman käyttö oli heidän mielestään helppoa, mutta sen avulla kokonaisten kudosnäytteiden analyysi oli hankala: tutkijan tuli valita analysoitava alue, mikä saattoi vaikuttaa tuloksiin. Tutkijoiden mukaan ohjelma sopii hyvin mikroarray- tyyppisiin, pelkästään kasvainkudoksen soluja sisältävien kudosnäytteiden immunovärjäyksien analyyseihin. Sen sijaan sen käyttö on hankalampaa kokonaisissa kudosleikkeissä, joissa antigeenin sijainnissa on gradienttieroa eri kasvainvyöhykkeiden alueilla. Se ei myöskään sovellu tapauksiin, joissa tulisi analysoida antigeenin tarkka sijainti suhteessa soluun.

Sylkirauhaskasvaimet muodostavat esiintyvyydeltään harvinaisen mutta histologiselta kuvaltaan monimuotoisen kasvainryhmän. Ne voivat saada alkunsa kolmesta eri solutyypistä, ja näin ollen niiden kirjo on varsin laaja. Maailman terveysjärjestön (WHO:n) vuonna 2017 julkaisema epiteliaalisten sylkirauhaskasvainten jaottelu koostuu 20 pahanlaatuisesta ja 11 hyvänlaatuisesta kasvaintyypistä. Sylkirauhaskasvainten diagnostiikka on erittäin haastavaa, ja siihen tarvitaan normaalien hematoksyliini-eosiini -leikkeiden (HE-leikkeet) lisäksi lähes aina niin kutsuttuja immunohistokemiallisia värjäyksiä. Alan kirjallisuudessa kullekin sylkirauhaskasvaintyypille on määritetty tyyppi-immunoprofiili, joka voi kuitenkin vaihdella tapauskohtaisesti. Tämän tutkielman tarkoituksena oli luoda kuva-arkisto, johon on taltioituna kuvia sylkirauhaskasvaintapausten immunohistokemiallisista värjäyksistä. Arkisto tehtiin Helsingin yliopistollisen keskussairaalan patologian laitoksen käyttöön diagnostiseksi apuvälineeksi. Kuvista voidaan nähdä, mitä immunomerkkiaineita eri sylkirauhaskasvaintyypit ilmentävät ja millä voimakkuudella. Kuva-arkiston aineistoksi koottiin Helsingin yliopistollisen keskussairaalan patologiseen keskuslaboratorioon normaaliin patologiseen tutkimukseen tulleita sylkirauhaskasvainnäytteitä. Aineistoksi valittiin 12 sylkirauhaskasvaintapausta, jotka edustavat kymmentä eri epiteliaalista sylkirauhaskasvaintyyppiä. Näytteiden HE- leikkeet ja niistä tehdyt immunohistokemialliset värjäykset kuvattiin mikroskooppikameralla eri suurennoksilla. Nämä kuvat koottiin kuva-arkistoksi, johon on pääsy Patologian laitoksen kotisivujen kautta. Syventävän tutkielman osuuteen koottiin suppea otos kuva-arkiston kuvista edustamaan kunkin kuvatun sylkirauhaskasvaintapauksen immunoprofiilia. Lisäksi syventävän tutkielman osuuteen sisältyy kirjallisuuskatsaus kuvatuista sylkirauhaskasvaintyypistä. Kuva-arkiston kuvista voidaan havainnoida kuvattujen sylkirauhaskasvaintapausten histologinen kuva ja immunoprofiili. Vanhoja tapausesimerkkejä voidaan käyttää vertailukohtana diagnosoitaessa uusia sylkirauhaskasvaimia, kunhan otetaan huomioon, että arkistossa on nähtävissä vain yksittäisiä esimerkkejä siitä, miltä kunkin kasvaintyypin immunoprofiili voi näyttää.

INTRODUCTION: Differentiating atypical lipomatous tumours (ALT) and well-differentiated liposarcomas (WDLS), also known as grade 1 liposarcomas (G1LS), from benign lipomas is a common diagnostic problem for pathologists. ALT/WDLS are characterised by amplification of the murine double minute 2 (MDM2) gene and our aim was to investigate if immunohistochemistry for MDM2 can be used to diagnose ALT/WDLS. We also reported treatment and calculated survival rates for patients with grade 1 liposarcomas (G1LS) at Helsinki University Central Hospital (HUCH). METHODS: 25 lipomas, 17 ALT and 21 G1LS were reviewed and initiated for MDM2 immunohistochemistry. For the clinical cohort we included 53 patients with a final diagnosis of G1LS during 1995-2007. RESULTS: The sensitivity of MDM2 immunohistochemistry for ALT and G1LS was 35% and 86%, respectively. The specificity in distinguishing ALT and G1LS from lipomas was 100%. The 5-year local-recurrence free survival (LRFS) for G1LS was 80%, and the 10-year LRFS was 68%. Local recurrence occurred in 16/53 patients. Retroperitoneal and intra-abdominal tumours had a 4.224 times greater risk of local recurrence compared to tumours in the extremities or trunk wall. Only one patient died due to G1LS. DISCUSSION: MDM2 immunohistochemistry is a good supportive method when diagnosing lipomatous tumours. It was highly specific in differentiating ALT and G1LS from lipomas and also relatively sensitive in recognising ALT and G1LS. We reported that G1LS are recurring tumours with tumour site strongly affecting the risk of local recurrence. Despite the high risk of local recurrence, the mortality of G1LS is low.

Neuropatisk smärta (NS) är vanligare hos kvinnor. Fastän nyligen utförd forskning tyder på att patofysiologin är olik hos könen, har primärt handjur studerats tidigare. För att bättre förstå könsskillnader vid NS undersökte vi hon- och hanråttors smärtbeteende efter en perifer nerv-skada samt analyserade vävnader med systembiologiska metoder. En perifer nervskada orsakades hos hon- och hanråttor, sham-operationer utfördes på kontroll-grupperna. Mekanisk och köldallodyni mättes med von Frey filament, respektive acetontest före operationerna, efter sju och 21 dagar. Ryggmärgsprovers och dorsalrotsganglioners genexpress-ion analyserades sju dagar efter operationerna. L4-L5 ryggmärgssegment (IBA1 och GFAP) och dorsalrotsganglionerna (CGRP och IB-4) samlades för immunohistokemi och cerebrospinal-vätska för proteomik efter 21 dagar. En kraftigare mekanisk allodyni uppstod hos honråttorna. Bägge könen utvecklade en tidig kraf-tig köldallodyni. De immunohistokemiska markörerna påvisade en liknande nervskada i dorsal-rotganglierna och liknande mikroglia- och astrocytaktivitet i ryggmärgen hos könen. Cerebrospi-nalvätskans proteiner påverkades inte. Många gener i dorsalrotsganglierna visade könsspecifik genexpression efter nervskadan, exempelvis cd28, cd274, ctla4, dpp4, hrh3, il1b och thbs4; i ryggmärgen uppvisade bland annat generna atf3, ccl2, och pdyn könsspecifika förändringar. Hondjuren uppvisade kraftigare smärtbeteende, och vi identifierade många gener som kunde förklara den observerade skillnaden. T-lymfocytresponsen och flera andra till NS kopplade mekanismer verkar vara olika i de två könen. Generna är kandidater för vidare forskning och våra resultat understryker betydelsen av att könen undersöks skilt i smärtstudier. (219 ord)

Background: Colorectal cancer is one of the most commonly diagnosed malignancies worldwide. Several biomarkers have been suggested for improved prognostic evaluation, but few methods have been implemented in clinical practice. Astroprincin (APCN) is a recently discovered transmembrane glycoprotein. It is shown to correlate with invasive growth behaviour of melanoma and breast cancer. Aim: To evaluate the value of APCN expression as a prognostic marker in colorectal cancer (CRC). Methods: Our cohort included 840 patients surgically treated between 1983 and 2001. Immunohistochemical expression of APCN was successfully evaluated in 739 patients. APCN expression and association with clinicopathological parameters and patient survival was assessed. Results: Strong positive staining was seen in 82 tumors (11.1 %), moderately positive in 288 (39%), weakly positive in 333 (45.1%), and negative in 36 (4.9%). High APCN expression associated with high tumour stage (p < 0.001). Patients with high tumor expression of APCN had a significantly worse disease specific survival (DSS) than those with APCN negative or weakly positive tumor (p < 0.001). In multivariate analysis APCN expression was an independent marker of poor prognosis. Conclusions: APCN is an independent prognostic marker in colorectal cancer and might be useful as a prognostic tool in colorectal cancer.