Browsing by Subject "immunohistokemia"

Borna-virus (BDV) aiheuttaa Bornan taudin, joka on vakava aivokalvojen, aivojen ja selkäytimen tulehdus (meningoenkefalomyeliitti). Bornan tauti johtaa liike- ja käytöshäiriöiden kautta usein kuolemaan. Tauti on saanut nimensä saksalaisen Bornan kaupungin mukaan, jossa tautiepidemia raivosi hevosten keskuudessa 1800-luvun lopulla. Bornan tautia pidettiin pitkään vain hevosten ja lampaiden sairautena endeemisellä alueella Keski-Euroopassa. Tutkimuksen lisäännyttyä viime vuosina on Borna-viruksen levinneisyysalue kasvanut Aasiaan, Afrikkaan ja Pohjois-Amerikkaan saakka. Hevosten ja lampaiden lisäksi Borna-virus tarttuu lukuisiin muihin selkärankaisiin, mm. ihmiseen. Borna-virus on ei-segmentoitunut, yksijuosteinen, negatiivisäikeinen ja vaipallinen RNA-virus. Se on lisääntymisominaisuuksiltaan ainutlaatuinen ja kuuluu yksin omaan Bornaviridae-heimoonsa. Borna-virus hakeutuu ensisijaisesti hermosoluihin, mutta ei aiheuta merkittävää solutuhoa. Borna-virusinfektion diagnosoiminen elävältä eläimeltä on hankalaa. Verinäyte voidaan tutkia serologisin ja molekyylibiologisin menetelmin, mutta luotettavaan Bornan tauti -diagnoosiin päästään vasta osoittamalla virus tai sen osia aivoista kuoleman jälkeen. Yksi tällainen menetelmä on immunohistokemia, joka perustuu viruksen proteiinien osoittamiseen. Syventävien opintojen tutkielmassa pystytettiin ABC-detektioon perustuva immunohistokemiamenetelmä Borna-viruksen N- ja P-proteiinien osoittamiseksi aivokudoksesta. BDV-proteiinien esiintyvyys suomalaisten eläinten aivoissa kartoitettiin. Tutkimukseen valittiin ne vuosina 1977-2002 neurologisin oirein kuolleet tai lopetetut kissat (38 kpl) ja hevoset (14 kpl), joiden oireille ei ollut löytynyt selittävää syytä ruumiinavauksessa eläinlääketieteellisen tiedekunnan patologian laitoksella, ja joista oli mahdollista saada aivonäytteitä. Menetelmän pystytyksessä käytettiin kokeellisesti infektoitujen hiirten ja rottien sekä luonnollisesti infektoituneiden kissojen ja hevosen formaliinissa fiksoituja, parafiiniin valettuja aivonäytteitä. Mukana menetelmässä oli kaksi polyklonaalista ja yksi monoklonaalinen vasta-aine. Tutkimuksessa kriteerit positiiviselle tulokselle olivat tiukat epäspesifien tulosten välttämiseksi. Positiivisina pidettiin näytteitä, jotka värjäytyivät kaikilla kolmella vasta-aineella. Yhtään Borna-viruspositiivista potilasta ei löytynyt. Tulos ei kuitenkaan poissulje Borna-virusinfektion mahdollisuutta. Tutkimus oli retrospektiivinen, joten tutkittaviksi ei voitu valita niitä aivoalueita, joissa BDV-antigeenia yleisimmin esiintyy. Mikäli suomalainen Borna-viruskanta on antigeenisilta ominaisuuksiltaan erilainen kuin se, jonka avulla vasta-aineet on tuotettu, todellisia positiivisia näytteitä on voinut jäädä huomaamatta. Lisäksi BDV-proteiinien ilmentyminen vaihtelee infektion vaiheesta riippuen.

Kokeen tarkoituksena oli selvittää ruokintaperäisen oksidatiivisen stressin vaikutusta solun hienorakenteeseen ja Cu-Zn-superoksididismutaasientsyymin esiintymiseen oksidatiiviselle stressille alttiissa elimissä (luusto- ja sydänlihas sekä maksa) sialla. Lisäksi tutkittiin punasolujen superoksididismutaasiaktiivisuus (E-SOD) . Kolme kuukautta kestäneen koejakson aikana seurattiin porsaiden kasvua ja veriparametreja (Hb, Hkr, S-CK, S-kol.) sekä punasolujen SOD:n aktiivisuutta. Obduktiossa havaittujen makroskooppisten löydösten sekä valomikroskopian, elektronimikroskopian ja immunohistokemian keinoin selvitettiin degeneratiivisten vaurioiden luonnetta ja CuZn-SOD:n lokalisaatiota soluissa. Elektronimikroskooppisesti havaittiin koeporsailla tutkittavissa elimissä runsaasti lysosomeja, degeneroituvia mitokondrioita, vaihtelevanasteista lipidoosia ja varhaisia lipofuskiini- ja keroiidimuodostelmia. Immunolokalisaation avulla lysosomaalisen CuZn-SOD:n todettiin vapautuvan lysosomeista näiden yhtyessä mitokondrioihin tai lysosomikalvon muuten hajotessa.

Krooninen hepatiitti on yleisin maksasairaus koiralla. Sen aiheuttaja jää usein tuntemattomaksi. Tautiin voi sairastua minkä tahansa rotuinen koira, mutta tietyillä roduilla sairautta tavataan useammin. Krooninen hepatiitti on etenevä sairaus eikä siihen ole parantavaa hoitoa. Taudin etenemistä pystytään hidastamaan, jos se todetaan aikaisessa vaiheessa. Taudin diagnoosiin tarvitaan aina maksabiopsian histopatologinen tutkimus. Kroonisesta hepatiitista poiketen reaktiivinen hepatiitti on maksan vaste muualla kehossa tapahtuville patologisille tiloille, joista yleisimpiä ovat ruuansulatuskanavan ja virtsa- ja sukupuolielinten alueen tulehdukset. Reaktiivinen hepatiitti pystytään usein parantamaan hoitamalla taustasyy. Kroonisen ja reaktiivisen hepatiitin oireet ovat epäspesifejä. Lisäksi kroonisen hepatiitin ja reaktiivisen hepatiitin histopatologinen kuva on osittain päällekkäinen, joten erityisesti taudin alkuvaiheessa niiden erottaminen toisistaan on haastavaa. Tämän työn kirjallisuuskatsaus taustoittaa tutkimusosuuden ja kuvaa tutkimusosuuteen valitut menetelmät. Kirjallisuuskatsauksessa esitellään lukijalle maksan histologista rakennetta, tehdään lyhyt katsaus solukuoleman mekanismeihin ja esitellään koiran kroonista ja reaktiivista hepatiittia tauteina. Tutkimusosuudessa tutkittiin, onko maksabiopsioiden erikoisvärjäysten avulla mahdollista erottaa lievää kroonista hepatiittia ja lievää reaktiivista hepatiittia sairastavat potilaat toisistaan. Tutkimuksen hypoteesina oli, että kaspaasi 3 -immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitettavien apoptoottisten hepatosyyttien tai cresyl violet -värjäyksellä tunnistettavien nekroottisten (onkoottisten) hepatosyyttien määrä eroaa kroonisessa ja reaktiivisessa hepatiitissa. Tutkimuksessa vertailtiin kroonista hepatiittia (n=6) ja reaktiivista hepatiittia (n=6) sairastavien potilaiden sekä kontrolliryhmän (n=6) maksanäytteissä esiintyviä apoptoosin ja nekroosin määriä. Potilaiden jako kroonista hepatiittia sairastavaan ja reaktiivista hepatiittia sairastavaan ryhmään tehtiin potilaiden alaniiniaminotransferaasiarvojen perusteella. Kroonisen ja reaktiivisen hepatiitin ryhmien materiaaleina käytettiin vuosina 2015-2019 Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan patologian ja parasitologian oppiaineelle lähetettyjä koirien maksabiopsioita. Kontrolliryhmän materiaali koostui vuonna 2018 patologian ja parasitologian oppiaineella kerätyistä koirien ruumiinavausnäytteistä. Näytteet värjättiin sekä kaspaasi 3 -immunohistokemiallisella värjäyksellä (Cell Signaling, Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb) että cresyl violet -värjäyksellä. Kaspaasi 3 -värjäyksen näytteet analysoitiin digitaalisista kuvista, jotka oli digitoitu 3D Histec Pannoramic MIDI skannerilla (BioSiteHisto Oy). Cresyl violet -värjäykset mikroskopoitiin käyttäen Olympus BX51-mikroskooppia ja Moticam 1080 -kameraa. Näytteiden tilastolliseen analysointiin käytettiin www.socscistatistics.com -sivuston laskentaohjelmia. Tässä tutkimuksessa osoittautui, ettei tutkituilla värjäysmenetelmillä voida erottaa koiran lievää kroonista ja lievää reaktiivista hepatiittia toisistaan. Kaspaasi 3 -värjäyksessä tilastollisesti merkitsevä ero (p<0.05) havaittiin kontrolliryhmän ja kroonista hepatiittia sairastavan ryhmän välillä. Cresyl violet -värjäyksessä tilastollista merkitsevyyttä ei löydetty minkään ryhmän kesken. Cresyl violet -värjäyksen sivulöydöksenä nähtiin kuitenkin punaisella värjäytyviä, granuloita sisältäviä, tunnistamattomaksi jääneitä soluja kaikkien ryhmien näytteissä.

Prolyl oligopeptidase (POP, prolyl endopeptidase, EC 3.4.21.26) is a serine-type peptidase (family S9 of clan SC) hydrolyzing peptides shorter than 30 amino acids. POP has been found in various mammalian and bacterial sources and it is widely distributed throughout different organisms. In human and rat, POP enzyme activity has been detected in most tissues, with the highest activity found mostly in the brain. POP has gained scientific interest as being involved in the hydrolyzis of many bioactive peptides connected with learning and memory functions, and also with neurodegenerative disorders. In drug or lesion induced amnesia models and in aged rodents, POP inhibitors have been able to revert memory loss. POP may have a fuction in IP3 signaling and it may be a possible target of mood stabilizing substances. POP may also have a role in protein trafficking, sorting and secretion. The role of POP during ontogeny has not yet been resolved. POP enzyme activity and expression have shown fluctuation during development. Specially high enzyme activities have been measured in the brain during early development. Reduced neuronal proliferation and differentation in presence of POP inhibitor have been reported. Nuclear POP has been observed in proliferating peripheral tissues and in cell cultures at the early stage of development. Also, POP coding mRNA is abundantly expressed during brain ontogeny and the highest levels of expression are associated with proliferative germinal matrices. This observation indicates a special role for POP in the regulation of neurogenesis during development. For the experimental part, the study was undertaken to investigate the expression and distribution of POP protein and enzymatic activity of POP in developing rat brain (from embryonic day 14 to post natal day 7) using immunohistochemistry, POP enzyme activity measurements and western blot-analysis. The aim was also to find in vivo confirmation of the nuclear colocalization of POP during early brain ontogeny. For immunohistochemistry, cryosections from the brains of the fetuses/rats were made and stained using specific antibody for POP and fluorescent markers for POP and nuclei. The enzyme activity assay was based on the fluorescence of 7- amino-4-methylcoumarin (AMC) generated from the fluorogenic substrate succinyl-glycyl-prolyl-7-amino-4-methylcoumarin (Suc-Gly-Pro-AMC) by POP. The amounts of POP protein and the specifity of POP antibody in rat embryos was confirmed by western blot analysis. We observed that enzymatic activity of POP is highest at embryonic day 18 while the protein amounts reach their peak at birth. POP was widely present throughout the developmental stages from embryonic day 14 to parturition day, although the POP-immunoreactivity varied abundantly. At embryonic days 14 and 18 notably amounts of POP was distributed at proliferative germinal zones. Furthermore, POP was located in the nucleus early in the development but is transferred to cytosol before birth. At P0 and P7 the POP-immunoreactivity was also widely observed, but the amount of POP was notably reduced at P7. POP was present in cytosol and in intercellular space, but no nuclear POP was observed. These findings support the idea of POP being involved in specific brain functions, such as neuronal proliferation and differentation. Our results in vivo confirm the previous cell culture results supporting the role of POP in neurogenesis. Moreover, an inconsistency of POP protein amounts and enzymatic activity late in the development suggests a strong regulation of POP activity and a possible non-hydrolytic role at that stage.