Browsing by Subject "kampylobakteerit"

Kampylobakteerit ovat teollisuusmaissa tavallisimpia diagnosoituja bakteeriperäisen gastroenteriitin aiheuttajia. C. jejuni aiheuttaa noin 90-95 % infektioista ja C. coli tavallisesti 5-10 %. Suomessa sairastuu vuosittain noin 3000 henkilöä kampylobakterioosiin. Infektioiden määrä on vähäinen talvella ja keväällä, jolloin suurin osa tapauksista on ulkomaista alkuperää. Kesäkuukausien aikana kampylobakteeri-infektioiden määrä kasvaa ja tapauksista jopa puolet voi olla kotimaista alkuperää. Yleensä tapaukset ovat yksittäisiä ja epidemioita esiintyy harvoin. Tartuntalähteistä tärkeimpinä pidetään saastunutta juomavettä ja broilerinlihaa. Perinteiset kampylobakteerien tunnistamismenetelmät ruokanäytteistä ovat aikaa vieviä ja hankalia. Ne sisältävät näytteen esirikastuksen, viljelyn selektiivisille alustoille sekä biokemiallisen varmistuksen. Viime vuosina kampylobakteerien tunnistamiseen tarkoitetut nopeat menetelmät, kuten nukleiinihappohybridisaatio, PCR (polymerase chain reaction) ja ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay) ovat kehittyneet. Näiden pikamenetelmien kehitys avaa uusia mahdollisuuksia mm. teollisuudelle elintarvikevalvontaan. Opinnäytetyössä verrataan EiaFoss-ELISA-kampylobakteerimenetelmää, viljelymenetelmää ja PCR-analyysia C. jejunin ja C. colin toteamiseen ja tunnistamiseen broilertuotteista. EiaFoss-ELISA-menetelmä on kvalitatiivinen määritysmenetelmä C. jejunin ja C. colin tunnistamiseen elintarvikkeista (rikastus 46 h + täysin automatisoitu analyysi 2 h). ELISA-analyysi perustuu "sandwich"-tekniikkaan, jossa kaksi erilaista polyklonaalista vasta-ainetta ovat kampylobakteeriantigeeneja vastaan. Viljelymenetelmä sisältää näytteen rikastuksen, viljelyn CCDA-maljalle (valikoiva kampylobakteerialusta ilman verta), maljojen inkuboinnin mikroaerofiilisissä olosuhteissa, tyypillisten pesäkkeiden jatkoviljelyn ja biokemiallisen varmistuksen. Valittu PCR-menetelmä sisältää rikasteliemen esikäsittelyn BDC (Buoyant Density Sentrifugation) menetelmällä, joka erottelee ominaispainoon perustuen bakteerit ja PCR-inhibittorit rikasteliemestä ja konsentroi bakteerit, sekä C. jejuni spesifisen PCR-analyysin. Tutkimuksessa analysoitiin yhteensä 105 tuotetta, joista 60 siipikarjatuotetta oli valittu juuri menetelmien vertailuun. Vaihtelut kaikkien kolmen menetelmän tuloksissa olivat vähäisiä. EiaFoss-positiivisia oli 13, PCR-positiivisia 10 ja viljely-positiivisia näytteitä 10. Varmaksi positiiviseksi tulokseksi määriteltiin sellainen näyte, joka antoi kahdella tai kaikilla kolmella menetelmällä positiivisen tuloksen. Näin ollen varmojen positiivisten määrä oli 12, joista 11 kyseessä oli C. jejuni ja yhdessä C. coli. Sekä EiaFoss- että BDC-PCR-menetelmissä väärien negatiivisten tulosten osuus oli 1,7 % näytteistä. Viljelymenetelmän väärät negatiiviset (3,3 %) johtuivat todennäköisesti valitusta pitkästä rikastusajasta, eivätkä siksi anna täysin oikeaa kuvaa kampylobakteereiden tunnistamisesta viljelemällä. EiaFoss-menetelmällä esiintyi vääriä positiivisia tuloksia (viljely- ja PCR-negatiivisia) 3,3 %. Viljely- ja BDC-PCR-menetelmissä ei esiintynyt vääriä positiivisia. Tämän perusteella sekä EiaFoss- että BDC-PCR-menetelmät osoittautuivat helpoiksi ja luotettaviksi pikamenetelmiksi tunnistaa kampylobakteerit broilernäytteistä.

Kampylobakteerit ovat merkittäviä ihmisen bakteeriperäisen suolistotulehduksen aiheuttajia. Näiden spiraalinmuotoisten bakteerien tärkeitä reservoaareja ovat mm. siipikarja, sika, nauta sekä luonnonvaraiset linnut ja nisäkkäät. Yleensä ihminen saa tartunnan eläimen ulosteen kampylobakteereilla kontaminoituneesta elintarvikkeesta tai vedestä. Vuonna 1998 Suomessa diagnosoitiin 2938 ihmisen kampylobakteeri-infektiota. Elokuussa 1998 Haukiputaalla kampylobakteerien kontaminoima juomavesi sairastutti 2200 henkilöä. Kampylobakteerit vaativat erityisolot kasvaakseen. Vesinäytteiden tutkiminen asettaa eristämismenetelmien ja elatusaineiden herkkyydelle ja selektiivisyydelle erityisvaatimukset: kampylobakteerien pitoisuus vedessä on usein alhainen, kilpailevaa mikrobiflooraa voi olla huomattavasti ja toisaalta kampylobakteerien infektiivinen annos on pieni. Tässä tutkimuksessa vertailtiin alunperin elintarvikeiden C. jejunin ja C.colin eristämiseen tarkoitettujen menetelmien, nk. Boltonin menetelmän (Bolton ym., 1992) sekä NMKL:n menetelmän (nro 119, 2. painos, 1990) herkkyyttä ja selektiivisyyttä vesinäytteiden kampylobakterien eristämisessä. Tutkimuksen ensimmäisessä osassa eristettiin y.m. menetelmin tunnettuja kampylobakteerikantoja suola-peptonivesilaimennossarjoilta. Toisessa osassa kampylobakteereita eristettiin luonnonvesinäytteistä. Kolmannessa osassa luonnonvesinäytteistä määritettiin kampylobakteerit kvantitatiivisesti putkimenetelmällä (MPN, most probable number). Tutkimuksen perusteella erot Boltonin ja NMKL:n menetelmien välillä olivat vähäiset ja menetelmät pikemminkin täydensivät toisiaan; Boltonin menetelmä oli hieman herkempi ja selektiivisempi mutta ero ei ollut tilastollisesti merkittävä.

Kampylobakteerit ovat gram-negatiivisia, kaarevia tai s-muotoisia, motiileja sauvabakteereita. Niitä on kirjallisuudessa kuvattu ainakin 13 lajia, lisäksi useita alalajeja tai variantteja. Kampylobakteereita löytyy yleisesti eläinten suolistosta, suun limakalvoilta sekä genitaalialueen limakalvoilta. Kampylobakteerit voivat aiheuttaa ihmiselle kuumeisen gastroenteriitin. Ne ovat useissa teollisuusmaissa yleisimpiä gastroenteriitin aiheuttajia. Tavallisimmat ihmiselle taudin aiheuttavat lajit ovat Campylobacter jejuni ja C. coli. Kampylobakteeritartuntojen määrä ihmisillä vaihtelee vuodenaikojen mukaan. Samoin niiden esiintymien mm. broilertuotteissa ja luonnonvesissä vaihtelee. Suomalaisilla ihmisillä kampylobakteeritartuntojen määrä lisääntyy selvästi loppukesällä ja alkusyksystä. Luonnonvesissä kampylobakteereita esiintyy eniten syksyllä ja talvella, ja vähiten kesällä. Fekaalisen saastumisen indikaattoriorganismeja, Escherichia coli ja muita koliformisia bakteereita sekä enterokokkeja, joutuu vesistöihin eläinten, ihmisten ja lintujen ulosteen mukana. Tutkimalla näitä indikaattoriorganismeja saadaan selville veden mikrobiologinen laatu. Fekaalisen saastumisen indikaattoriorganistmeille uimavesissä on asetettu enimmäisrajat, ja kaikkien yleisten uimarantojen vedestä on näitä bakteereita säännöllisesti määritettävä. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia kampylobakteerien esiintymistä Helsingin seudun uimarantojen vesissä ja pohjahiekassa kesällä 2003. Samalla tutkittiin uimarantojen veden mikrobiologista laatua määrittämällä siitä fekaalisen saastumisen indikaattoriorganismeja eli koliformiset bakteerit, Escherichia coli ja enterokokit. Vesinäytteitä tutkittiin 64 kappaletta, joista kahdesta löytyi kampylobakteereita. Kampylobakteerit olivat ominaisuuksiensa perusteella todennäköisesti Campylobacter jejuni-lajia. Pohjahiekkanäyytteitä tutkittiin 35 kappaletta, eikä yhdenkään todettu sisältävän kampylobakteereita. Fekaalisen saastumisen indikaattoriorganismien määrät eivät kertaakaan ylittäneet niille annettuja raja-arvoja, joten uimavesien laatu oli tutkituilla rannoilla hyvä. Kampylobakteerien määrään vesistöissä vaikuttaa sekä veteen joutuvien kampylobakteerien määrä että kampylobakteerien säilyminen vedessä. Veden korkea lämpötila ja auringon UV-säteet tuhoavat kampylobakteerit nopeasti. Merivedessä myös laimeneminen on tehokasta.

Kampylobakteerit on tunnistettu vasta viimeisten 30 vuoden aikana merkittäviksi ihmisten tautien aiheuttajiksi. Termofiiliset kampylobakteerit Campylobacter jejuni ja C. coli ovat yleisin bakteeriperäisten suolistoinfektioden syy maailmanlaajuisesti. Pääasiallinen oire on ripuli. C. jejuni voi aiheuttaa myös jälkitauteja, kuten reaktiivista niveltulehdusta, nokkosihottumaa tai kyhmyruusua (erytema nodosum). Näitä kuitenkin ilmaantuu harvoin (<1 %). Tärkein jälkitauti on Guillain-Barrén syndrooma, joka on akuutti ääreishermoja demyelinisoiva sairaus. Kesällä 2008 Helsingin yliopistossa toteutettiin tutkimus, jonka tarkoituksena oli kartoittaa kampylobakteerien esiintymistä Korkeasaaren eläintarhassa ja tunnistaa löytyneet kampylobakteerit lajitasolle. Aineisto koostui 196 tarhaeläimen ulostenäytteestä, kahdeksasta Korkeasaaressa vapaana olleen valkoposkihanhen ulostenäytteestä sekä 12 ympäristönäytteestä (vesinäytteitä). Vesinäytteet olivat eläinten kahluualtaista tai häkeissä kulkevista puroista. Ulostenäytteet olivat peräisin kaikkiaan 71 eläinlajista. Tutkituista eläinlajeista 40 oli nisäkkäitä, 26 oli lintuja ja viisi oli matelijoita. Näytteistä eristettyjen isolaattien tulosten perusteella ulostenäytteistä 21 (10,7 %) oli positiivisia kampylobakteerien suhteen. Eläinlajeja tarkasteltaessa kampylobakteerien suhteen positiivisia oli 17 (23,9 %) eläinlajia. Näistä kymmenen oli lintuja, kuusi nisäkkäitä ja yksi matelija. Positiiviseksi C. jejunin suhteen osoittautui 18 ulostenäytettä. Yhdestä emun näytteestä löytyi C. jejunin lisäksi myös C. coli. Kahdessa näytteessä, rubiini-ibis ja kannuskilpikonna, kasvoi jokin muu kampylobakteeri kuin C. jejuni tai C. coli. Eläinlajeja tarkasteltaessa voidaan todeta, että 15 (21,1 %) todettiin positiivisiksi C. jejunin suhteen. Näistä kymmenen oli lintuja ja viisi nisäkkäitä. C. coli löytyi vain yhdestä (1,4 %) eläinlajista (linnusta) sekä jokin muu kampylobakteeri kuin C. jejuni tai C. coli löytyi kahdesta (2,8 %) eläinlajista (yksi lintu ja yksi matelija). Vain yksi ulostenäyte osoittautui positiiviseksi arkobakteerin suhteen. Kyseessä oli rubiini-ibiksen näyte. Samasta näytteestä löydettiin myös C. jejuni. Kahdesta valkoposkihanhien näytteestä löytyi sekä helikobakteeri että C. jejuni. Viisi ympäristönäytettä osoittautui positiiviseksi arkobakteerien suhteen. Kolme positiivista näytettä oli lintualtaista ja kaksi nisäkkäiden altaista. Rubiini-ibiksen altaasta löytyi arkobakteerin lisäksi myös C. jejuni. Lähes kaikissa vesinäytteissä (9/12) oli koliformisia bakteereja Colilert® testillä yli määritysrajan (>2419,6 bakteeria 100 ml:ssa näytettä). Suurimmasta osasta vesinäytteitä (8/12) saatiin tulokseksi myös yli menetelmän määritysrajan E. colia. Kaikenkaikkiaan tulosten perusteella voi päätellä, että vierailijoiden riski saada kampylobakterioosi Korkeasaaren eläintarhassa on suhteellisen pieni. Ainoana suurempana riskitekijänä voisi pitää valkoposkihanhien ulostetta. Sitä on maassa runsaasti ja sitä saattaa myös kulkeutua kenkien mukana jopa kotiin asti. Eläintarhan työntekijöiden tulee muistaa hyvä käsihygienia oltuaan kosketuksissa joko eläimien kanssa tai käytyään näiden tarhoissa. Työntekijät saattavat myös levittää eläintarhan eläinten ulostetta saappaissaan vierailijoidenkin kulkureiteille.

Koirien ja kissojen suolistoissa esiintyy yleisesti kampylo- ja helikobakteereita. Ne yhdistetään eläimissä usein ripuliin, mutta monia lajeja löytyy yhtä paljon myös oireettomilta eläimiltä. Kiinnostusta näihin bakteereihin lisää niiden vielä toistaiseksi epäselvä patogeenisuus ihmisille sekä mahdollinen leviäminen eläimistä ihmisiin. Enterohepaattisten helikobakteereiden taksonomiassa on tapahtunut lähivuosina ja tapahtuu yhä muutoksia. Kaikkien lajien ominaisuudet eivät ole vielä täysin tiedossa. Tässä työssä tutkittiin eri kampylo- ja helikobakteerilajien esiintymistä suomalaisten koirien ja kissojen suolistoissa. Näytteiden viljelyssä käytettiin erilaisia kasvualustoja, joiden sisältämät antibiootit suosivat eri tavoin eri lajien kasvua. Koiranäytteistä (46) positiivisia kampylo- ja helikobakteerien suhteen oli 54%, kissanäytteistä (26) 50%. Koirilla esiintyvät lajit olivat Campylobacter coli, C. lari, C. upsaliensis, Helicobacter canis, "H. colifelis" ja Helicobacter sp. flexispira ryhmä 8. Kissoilla esiintyvät lajit olivat C. upsaliensis, C. helveticus, sekä "H. colifelis". Kampylobakteereiden eristystä varten kefoperatsonia sisältävät kasvualustat ovat hyviä, helikobakteereista ainakin "H. colifelis" kasvaa hyvin nalidiksiinihappoa sisältävällä alustalla. Bakteerien sekakasvu näytteistä teki eristyksen hankalaksi.

Tutkielman kirjallisuusosassa esitellään kampylobakteerilajit ja niiden ominaisuudet. Ne ovat gramnegatiivisia mibroaerofiilisia bakteereja, jotka aiheuttavat erilaisia infektioita sekä ihmisille että eläimille. Infektiot ovat tavallisesti elintarvikeperäisiä. Sukuun luetaan tällä hetkellä kuuluvaksi 13 lajia, joista tunnetuin on C. jejuni. Kampylobakteerien luokittelu on ollut vaikeaa, koska ne ovat suhteellisen inaktiivisia biokemiallisissa testeissä. Uudempien molekyyli -biologisten menetelmien avulla on saatu selvyytta taksonomiaan. Kirjallisuusosassa on keskitytty lajeihin C. upsaliensis ja C. helveticus, jotka olivat tutkimuksessa erityisen kohteena. Nämä lajit ovat uudempia ja vähemmän tutkittuja lajeja, ja niiden zoonoosiluonteesta ollaan kiinnostuneita. Niitä on eri tutkimuksissa eristetty koirien ja kissojen ulosteesta sekä ihmisiltä. Tavallisimmat humaani-infektiot ovat olleet enteriittejä. Suuri osa koirien ja kissojen eristyksistä on tehty terveiltä yksilöiltä. Kokeellisessa osassa kartoitettiin kampylobakteerien yleisyyttä koirien ja kissojen ulostenäytteissä Tutkimusmenetelmänä käytettiin kalvosuodatusmenetelmää, jonka avulla voidaan löytää useita eri kampylobakteerilajeja yhtäaikaa Tutkimusaineisto koostui pääasiassa Eläinlääketieteellisen korkeakoulun pieneläinsairaalan potilaista. Näytteitä kerättiin yhteensä 200 eläimestä. Nämä olivat sekä kliinisesti terveitä että sairaita. Tutkituista eläimistä 25 oli kissaa ja 175 koiraa. Näytteet otettiin steriilillä vanutikulla suoraan peräsuolesta ja säilytettiin BHI-liemessä Brusella- tai BHI-agarille viljelyyn asti. Alustoja inkuboitiin mikroaerofiilisesti 2-3 vrk tta. Kasvustoista tehtiin gramvärjäys biokemiallisia testejä, antibioottiherkkyyskoe ja SDS-PAGE -kokosoluproteiiniprofiili. Tulosten perusteella määritettiin eristettyjen kantojen lajipositiivisia näytteitä oli 48 tutkituista 200 näytteestä. Eniten eristettün C. upsaliensista ja toiseksi eniten C. helveticus. Eräät kannat olivat todennäköisesti helikobakteereja. Kampylobakteerien erottelussa helikobakteereista tärkeimpiä testejä oli bakteerien tunnistaminen morfologian avulla. Tutkimuksen perusteella kampylobakteerit, etenkin C. upsaliensis ja C. helveticus, näyttäisivät olevan melko yleisiä koira- ja kissapopulaatiossa muodostaen näin ollen varteenotettavan zoonoottisen riskin.

One of the leading bacterial causes of diarrhea in humans are campylobacters (Campylobacter spp). The more common species infecting humans are Campylobacter jejuni and C. coli. The symptoms can vary from mild intestinal infection to severe, bloody, producing diarrhea. Improperly prepared poultry, contaminated drinking and swimming water are the leading causes of infection. Campylobacters are present in the intestines of many mammal and bird species. They generally do not cause disease in the birds, thus they are regarded as asymptomatic carriers. Birds and mammals can also infect swimming areas through defecation. This contamination is generally studied with the help of a fecal indicator bacteria. Examples of this type of bacteria are Escherichia coli, fecal enterococci, and Clostridium perfringens. Since the 1990s Campylobacter has become increasingly resistent to antibiotic treatments, such as fluoroquinolones, and it has become an escalating public health threat. The antibiotic resistance of E. coli can be used to illustrate that of gram-negative bacteria. Fecal samples of 125 birds were collected for the qualitative study of Campylobacter and E. coli. 41 Barnacle geese and 84 gulls were studied. The presence of Campylobacter was studied by a cultivation. The enrichment was processed in Bolton broth and then cultured with CCDA (modified charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar). Campylobacters were identified with typical colonies and gram-staining. The E coli was cultured directly from the sample swabs to the mFC agar. The typical blue growing colonies were interpreted as E. coli. This was confirmed introducing the E coli's β-glucuronidase enzyme into Colilert solution. In addition, 18 fecal samples were collected (13 Barnacle geese and 5 gulls) for quantitative analysis. The cfus of fecal enterococci, E. coli, C perfringens and Campylobacters were determined using a tenfold dilution method. Water samples were gathered three times during the summer from five different swimming areas in Helsinki. These samples were studied for counts of fecal enterococci, E.coli, C perfringens and the presence of Campylobacter by membrane filtration method the. The quantity of E. coli was studied using the commercial MPN method, Colilert test. The E. coli and Campylobacter were isolated from the fecal and water samples and were examined for antimicrobial resistance. To ampicillin, ciprofloxasin, and tetracycline. The erythromycin resistance of Campylobacter was studies as well. The method used were agar dilution and MIC values were determined.. Campylobacter was detected in 23 fecal samples (18%). It was found in 8 gull fecal samples (10%) and in 15 Barnacle geese samples (37%). Seven of the isolated strains (31%) were C. jejuni. It was noticed in the quantitative studies that there were more E. coli and fecal enterococci in the gull fecal samples (collected from the Ämmässuo landfill) than the Barnacle geese fecal samples. The bacteria levels found in the Helsinki beach areas were not above the legal reference levels. Campylobacters were identified once at two beach areas. Almost all of studied Campylobacter isolates were sensitive to the antibiotics used in the experiment. Two strains were resistance to the ampicillin. Of the 76 E. coli strains 5 were resistant to ampicillin and 4 to tetracycline. The other strains were sensitive. One multiresistant E. coli strain was detected in a swimming water sample. Campylobacters were detected in fecal samples of birds suggesting that wild birds may be the source of the Campylobacter infection in humans. Escherichia coli fecal enterococci were not suitable fecal indicator bacteria for fecal contamination of Barnacle geese in bodies of water in nature. The quality of water in Helsinki's swimming areas appeared to be good. Resistance to antibiotics seems to be quite rare in bacterium isolated from birds feces and swimming waters. Probably, birds are not remarkable spreaders of antibiotic resistance.