Browsing by Subject "mikroRNA"

MicroRNAs are ~22 nucleotide long RNA strands which regulate gene expression by binding to the 3’UTRs of messenger RNAs. MicroRNAs are predicted to regulate about a half of all protein-coding genes in the human genome thus affecting many cellular processes. One crucial part of microRNA biogenesis is the cleaving of pre-miRNA strands into mature microRNAs by the type III RNase enzyme, Dicer. Dicer has been shown to be downregulated due to aging and in many disease states. Particularly central nervous system disorders are linked to dysregulated microRNA processing. According to the latest studies, Dicer is crucial to the survival of dopaminergic neurons and conditional Dicer knockout mice show severe nigrostriatal dopaminergic cell loss, which is a hallmark of Parkinson’s disease. By activating Dicer with a small-molecule drug, enoxacin, the survival of dopaminergic cells exposed to stress is significantly improved. However, enoxacin, which is a fluoroquinolone antibiotic, activates Dicer only at high concentrations (10-100 μM) and is polypharmacological, which may cause detrimental side effects. Therefore, enoxacin is not a suitable drug candidate for Dicer deficiencies and better Dicer-activating drug candidates are needed. The aim of this work was to develop a cell-based fluorescent assay to screen for Dicer-activating compounds. Assays which measure Dicer activity have already been developed, but they have some pitfalls which don’t make them optimal to use for high-throughput screening of Dicer-activating compounds. Some are cell-free enzyme-based assays and thus neglect Dicer in its native context. The RNA to be processed by Dicer does not represent a common mammalian RNA type. Most assays do not have internal normalizing factors, such as a second reporter protein to account for e.g. cell death, or the analysis method is not feasible for high-throughput screening data. Considering these disadvantages, the study started by designing a reporter plasmid in silico. The plasmid expresses two fluorescent proteins, mCherry (red) and EGFP (green), and a mCherry transcripttargeting siRNA implemented into a pre-miR155 backbone which is processed by Dicer. Thus, measuring the ratios of red and green fluorescence intensities will give an indication on Dicer activity. The plasmid also has additional regulatory elements for stabilizing expression levels. The plasmid was then produced by molecular cloning methods and its functionality was tested with Dicer-modulating compounds. The assay was optimised by testing it in different cell lines and varying assay parameters, and stable cell lines were created to make large-scale screening more convenient. Finally, a small-scale screen was done with ten pharmacologically active compounds. Transiently transfected, in Chinese hamster ovarian cells, mCherry silencing was too efficient for reliable detection of improvement in silencing efficiency due to floor effect. With an inducible, Tet-On, system in FLP-IN 293 T-Rex cells, the expression could be controlled by administering doxycycline and the improvement in silencing was quantifiable. The assay seemed to be functional after 72 hours and 120 hours of incubation using enoxacin (100 μM) as a positive control. However, the screening found no compounds to significantly reduce mCherry/EGFP fluorescence ratio and, additionally, the effect of enoxacin was abolished. Therefore, a more thorough analysis on the effects of enoxacin was done and, although statistically significant, enoxacin was only marginally effective in reducing mCherry/EGFP fluorescence ratio after 72 hours of treatment. It should be noted from the small-scale screening that metformin and BDNF, compounds previously shown to elevate Dicer levels, showed similar effects to enoxacin. The quality of the assay in terms of high-throughput screening was determined by calculating Zfactors and coefficients of variations for the experiments, which showed that the variability of the assay was acceptable, but the differences between controls was not large enough for reliable screening. In conclusion, the effects of metformin and BDNF should be further studied and regarding the assay, more optimisation is needed for large-scale, high-throughput, screening to be done with minimal resources.

Selective degeneration and dysregulation of specific neuronal populations is a common hallmark shared by neurodegenerative diseases affecting the aging population. Parkinson’s disease (PD) is one of the most prevalent neurodegenerative diseases with debilitating clinical manifestations that follow a chronic and progressive course. Pathological hallmarks of PD involve gradual and specific loss of DA (DA) neurons and widespread presence of Lewy body (LB) inclusions that consist of aggregated presynaptic protein, α-Synuclein (αSyn). Treatment of PD remains to be at symptomatic management as the underlying mechanisms that trigger neurodegeneration are still not fully elucidated. Over the past two decades, microRNAs (miRNAs) have become a major area of interest within biomedical fields and gained increasing momentum in the context of neurodegenerative diseases. In recent developments, changes in mature miRNA profiles have been reported in aging tissue and many age-related diseases, including PD. More recently, a number of studies have found that the most essential enzyme in the miRNA biogenesis pathway, Dicer, exhibits reduced expression with aging. To these ends, a genetic mouse model based on heterozygous knockout of Dicer (DicerHET) was introduced to simulate Dicer downregulation. Initial investigations identified the DicerHET model as a promising tool for studying the relationship between disrupted miRNA biogenesis and neurodegeneration associated with PD. To facilitate future investigations and speed up screening of potential therapeutic compounds using this genetic model, in the current work, we aimed to produce a DicerHET in vitro model with a practical and convenient genetic engineering approach. The main focus of this work was to validate the model and establish a standardized reproducible approach suitable for research that addresses the role of miRNA biogenesis in PD. The desired DicerHET genotype was generated in vitro by employing traditional Cre/loxP system in conjunction with a virally mediated Cre expression. More specifically, primary cortical cultures, derived from Dicer flox/+ mice embryos, were transduced with Cre expressing lentiviral vectors (lenti-hSYN-T2A-Cre) to delete the “floxed” Dicer allele. To establish optimal parameters for the procedure, we analysed recombination efficiency under different transduction conditions. The most efficient recombination was achieved after 5 days of induction in cultures. However, we observed that DicerHET genotype did not attenuate survival of the cells, as assessed by immunohistochemistry. Further, as a proof of concept, we exposed the DicerHET cultures to pre-formed fibrils (PFFs) - a PD related stressor that causes αSyn aggregation. pSer129-αSyn-positive LB-like aggregates were detected in all the PFF-treated cultures, however, with a greater accumulation in the DicerHET cultures. Interestingly, increased aggregation was not accompanied by increased cell death, suggesting that DicerHET genotype does not increase vulnerability of cortical neurons to pSer129-αSyn aggregation. Based on our earlier studies we presume that DA neurons may bear a specific vulnerability towards the age-related Dicer depletion. More conclusive evidence on this intriguing relationship could be provided in future research using the DicerHET model that can be readily applied to primary DA cultures.

MikroRNA:t ovat tärkeitä, transkription jälkeen geenien ilmenemiseen vaikuttavia säätelijöitä. MikroRNA:iden tuotantoa on löydetty konservoituneena useista eri eliöryhmistä ja kudoksista, mikä osaltaan kertoo niiden toiminnan tärkeydestä. Rakenteeltaan miRNA:t ovat lyhyitä, noin 22 nukleotidin mittaisia yksijuosteisia RNA:ita, jotka tuotetaan pidemmistä esi-RNA:sta entsymaattisesti leikkaamalla. Geenien säätelyssä miRNA:iden teho perustuu niiden kykyyn tunnistaa kohdegeenit miRNA:n ja lähetti-RNA:n sekvenssien komplementaarisuuden perusteella. MikroRNA:iden kohteiden tunnistuksen kannalta tärkeätä, 6-8 nukleotidin jaksoa kutsutaan miRNA:n ydinalueeksi (seed-region). Yhdellä miRNA:lla voi potentiaalisesti olla satoja kohdegeenejä, joita se säätelee, minkä vuoksi näitä miRNA-mRNAinteraktioita on pyritty bioinformatiivisesti ennakoimaan useiden ohjelmien ja algoritmien avulla. miRNA:iden toiminnan tutkimista mutkistavat isomiR:it, jotka ovat yleisesti tunnettujen, kanonisten, miRNA:iden vaihtoehtoisia muotoja. IsomiR:ejä tuottavat poikkeamat miRNA:iden esiasteiden prosessoinnissa ja mikroRNA:ihin kohdistuva RNA-editointi. Tuloksena saadaan mikroRNA:ita joiden pituus tai emäskompositio eroavat kanonisista sekvensseistä. Myös miRNA:iden toiminta voi muun muassa alkaa kohdistamaan säätelyä eri geeneihin, kuin mitä kanonisen sekvenssin perusteella voisi olettaa. Tässä pro gradu -projektissa analysoin suurtehosekvensoinnilla tuotettua dataa kahdesta aivoalueesta kuudelta eri laboratoriohiirikannalta. Normalisoin datan ja todettuani sen laadun hyväksi jatkoin miRNA:iden ilmenemisen tarkastelua eri analyyseillä: Selvitin mitkä miRNA:t ilmentyivät tutkituilla aivoalueille jamiten niiden ekspressio erosi eri aivoalueiden ja hiirikantojen välillä. Tämän jälkeen tarkastelin miRNA:sta tuotettujen vaihtoehtoisten sekvenssien, isomiR:ien ilmentymistä. Vertailimme lisäksi aineistossa havaitsemiemme isomiR:ien ekspressiossa eroja aivoalueiden ja hiirikantojen välillä. Lopuksi pyrimme osoittamaan havaittujen isomiR:ejä tuottavien RNAeditointitapahtumien olevan funktionaalisesti merkittäviä. Tätä tarkoitusta varten transfektoimme soluviljelmiä lusiferaasi-reportterivektorilla ja editoiduilla ja editoimattomilla miRNA:ta muistuttavilla sekvensseillä. Analyysien tuloksena havaitsimme lukuisia miRNA:ita, jotka olivat eritavoin ilmentyneitä joko aivoaluiden, hiirikantojen tai molempien välillä. Lisäksi havaitsimme lukuisia isomiR-sekvenssejä: Noin 90%:sta havaittuja miRNA:ita löydettiin vähintään yksi vaihtoehtoinen, ei-kanoninen sekvenssi. IsomiR:ien suuresta määrästä huolimatta,miRNA:iden kokonaisekspressiosta suurin osaoli yleensä vain muutaman isomiR:in aikaansaannosta. Aineistoista löysimme myös runsaasti merkkejä RNA-editoinnista, ja erityisesti ADAR-entsyymin toiminnasta. Funktionaaliset kokeemme antoivat myös vahvoja viitteitä siitä, että miRNA:iden ydinalueisiin kohdistuvat editoinnit ovat funktionaalisesti merkittäviä tapahtumia. Muutosten seurauksena havaitsimme muuttuneiden ydinaluiden tunnistavan eri kohdegeenejä kuin kanoninen muuntelematon miRNA-sekvenssi. Johtopäätöksenä miRNA:iden ja erityisesti niiden isomiR:ien muunteluun on jatkossa syytä kiinnittää nykyistä enemmän huomiota. Parempi ymmärrys isomiR:eistä ja niitä synnyttävistä mekanismeista voivat jatkossa mahdollistaa tehokkaamman koesuunnittelun ja helpottaa saatujen tulosten tulkintaa.

Mukoepidermoidikarsinooma (MEC) on yksi yleisimmistä sylkirauhasten syövistä. Sen pahanlaatuisuusaste vaihtelee kolmella tasolla (matala - keskitasoinen - korkea), jotka määräytyvät WHO:n määrittämien kriteerien mukaisesti. WHO:n painottamien histopatologisten piirteiden tarkastelun tueksi on ehdotettu objektiivisia järjestelmiä, kuten geenifuusiot ja mikro-RNA-profiili. Ehdotukset perustuvat tutkimuksissa selvinneisiin havaintoihin, joissa on todettu tiettyjen geenifuusioiden liittyvän tuumorin pahanlaatuisuusasteeseen, ja mikro-RNA-molekyylien pitoisuuksien poikkeavan syöpäkudoksissa verrattuna normaalikudoksiin. Syövän pahanlaatuisuuden asteen määrittäminen vaikuttaa olennaisesti hoitovalintoihin ja potilaan selviytymiseen. Syövän pahanlaatuisuutta kuvaa muun muassa sen aggressiivisuus, mikä tarkoittaa syövän nopeaa kasvua ja levittäytymistä. Syövän levittäytymistä tyvikalvon läpi ja verenkierron kautta muihin kudoksiin kuvataan termillä invasiivisuus, jonka määrittämiseksi on kehitetty monenlaisia kokeellisia menetelmiä. Nämä menetelmät eroavat toisistaan olennaisimmin kasvualustojensa perusteella. Tämän syventävien opintojen tutkielman tarkoituksena on tarkastella mukoepidermoidikarsinooman (MEC) piirteitä, diagnosointia ja invasiivisuutta. Taustana kerrotaan lyhyesti sylkirauhasista sekä pään ja kaulan alueen syöpien tilastosta ja hoidoista. Lisäksi kerrotaan mikro-RNA-molekyyleistä, sekä esitellään CRISPR-menetelmä ja invasiivisuuden tutkimisessa käytettyjä menetelmiä. Kokeellisessa osuudessa pyrkimyksenämme on selvittää valittujen mikro-RNA- molekyylien (miR-22 ja miR-205) vaikutus MEC:n invasiivisuuteen kahdella eri invaasiokokeella, myooma- ja sferoidikokeilla. Sferoidikokeella saatiin selville, että miR-22- ja miR-205-molekyylien vaimentaminen MEC-soluista vähensi invaasiopinta-alaa. Tuloksemme ovat potentiaalisesti hyödyllisiä sylkirauhassyöpien diagnostiikassa sekä tarkennettujen syöpähoitojen kehityksessä.