Browsing by Subject "RT-PCR"

LCMV Lymphocytic choriomeningitis virus is a rodent-borne pathogen belongs to Arenaviridae family. Most of the studies have referred Mus musculus as the main reservoir of the LCMV. It has been detected in pet rodents, laboratory rodents, and wild mice. Humans be infected with LCMV through the ingestion or inhalation of sources contaminated with rodent feces, urine, or both. LCMV infection can be asymptomatic, present with mild symptoms, or it can cause aseptic meningoencephalitis (AME) and teratogenic effects in infants. However, clinical cases of LCMV infection have been rarely reported, and there is only fragmental knowledge on the presence and prevalence of LCMV infections around the world. Likewise, the genetic characteristics of the circulating LCMV strains and impact of LCMV on public health have remained poorly characterized. This study was performed in the Southern Iraq, due to the lack of comprehensive information about LCMV in this area. There were three main aims in this thesis. First, to assess the prevalence of LCMV among the healthy human population in the Nasiriyah region, southern Iraq. Second, to assess whether LCMV infections can be associated with neurological manifestations. Third, to characterize the genetic variation and evolutionary history of LCMV strains circulating in southern Iraq. Serum and CSF samples were collected from patients and healthy people in Nasiriyah governorate in the Southern Iraq. Serum samples were screened for LCMV using Immunofluorescence assay (IFA) to detect IgG and IgM antibodies. Real-time PCR was used to detect LCMV genome. In order to confirm the PCR positive samples, we sequenced these samples by Next-generation sequencing. The serological assay results showed 12.22% IgG prevalence of LCMV among healthy people and 7.36% IgG prevalence among patients with neurological symptoms. The IgM prevalence was 1.25% among the patients with acute infections. From symptomatic patients, we sequenced partial L-segments of two new LCMV strains. The phylogenetic tree constructed on the basis of all known LCMV strains suggested that these new LCMV strains from Iraq are genetically distant from the previously known LCMV strains and form a novel sub-cluster within LCMV species. This study is the first survey of LCMV in the Southern Iraq. LCMV appears to be a rather common infection in Iraq. I reported new strains of LCMV that are circulating in the study site and most likely is the causative agent of the central nervous system-associated clinical manifestations in these patients. For future work, I’m aiming the detection of other Arenaviruses spreading in the Southern Iraq.

The growing demand for crop products caused by population growth and climate change encourages plant scientists to investigate sustainable strategies to tackle such problems. Translating the knowledge of plant molecular mechanisms into applicable practices in the field would help in improving the plants' efficiency and productivity. The size of a plant's shoot apical meristem (SAM) is an important factor in biomass production and crop productivity. Besides, understanding the molecular regulation of the shoot apical meristem would help to know more about the 3D growth innovations of different plant families across the kingdom. This thesis aimed to study the regulation mechanisms of the meristem activity in Gerbera, the model organism of the Asteraceae family that has an informative phylogenetic position to understand evolutionary events. The inflorescence of Gerbera is highly resembling clv3 mutants in Arabidopsis. CLV3 peptide is involved in maintaining the meristem activity, these differences between the two species suggested an evolutionary modification for this pathway. GhCLV3-GhWUS signaling components in Gerbera hybrida were identified following bioinformatics approaches. Then sequence comparisons and phylogenetic analyses between Gerbera sequences and other species were performed. The coding sequence of GhCLV1 was cloned to expression vectors. The expression pattern analysis of the receptors was performed by RT-PCR and RNA-seq data. The results suggest that GhCLV1 is an important factor in maintaining the enlarged inflorescence meristem in Gerbera. Also, all the other receptors were expressed at different levels suggesting their contribution in the GhCLV3-GhWUS pathway and inflorescence termination.

Splicing of introns and joining of exons to yield mature and functional mRNA molecules is carried out through two sequential trans-esterification reactions by two distinct spliceosomes; the major U2-dependent and the minor U12-dependent spliceosomes. Alternative splicing is common in eukaryotes and occurs mostly with U2 type introns. The level of minor spliceosomes specific proteins, U11-48K and U11/U12-65K, are regulated via alternative splicing where U11 snRNP binds to the USSE (U11 snRNP binding splicing enhancer), a tandem repeat of 5’ss of U12-type introns, and activates an upstream 3’ss of the U2 dependent spliceosome. Here, I carried forward the study done in Verbeeren et al, 2010, through manipulation of the distance between the two 5’ss within the USSE element, and the distance between the upstream 3’splice site and USSE. The mechanisms through which USSE recognition by the U11 snRNP is achieved, as well as the distance constraints the USSE element imposes on alternative splicing, were analyzed. RT-PCR analysis shows that (a) occurrence of the alternative splicing event drops with reduced distance between 3’ss-USSE, and is finally lost when the distance is reduced to zero, (b) both increased and decreased distance between the two 5’ss within the USSE resulted in reduced long isoform formation. The data set suggests that the simultaneous binding of two 5’ss within USSE by U11/U12 snRNPs and their interaction is necessary for USSE mediated alternative splicing activation. So, the evolutionary conserved sequence within USSE, and the distance to 3’ss are critical for USSE mediated alternative splicing.

TCDD on voimakkain dioksiiniryhmän kemikaaleista. Dioksiinit ovat kaikkialla maapallolla esiintyviä ympäristösaasteita, jotka jo pieninäkin annoksina aiheuttavat monia biokemiallisia ja myrkyllisiä vaikutuksia selkärankaisissa. Dioksiinit ovat hyvin rasvaliukoisia, pysyviä ja elimistössä hitaasti hajoavia, minkä vuoksi ne kulkeutuvat elimistössä rasvakudokseen ja kertyvät ravintoketjussa. 1960-1970-luvuilla käytetyissä klooratuissa kemikaaleissa dioksiineja oli paljon epäpuhtauksina. Nykyään tärkeimmät dioksiinilähteet ovat jätteenpoltto ja muut polttoprosessit, metalliteollisuus ja aiemmin dioksiineilla saastuneet alueet. Suomessa dioksiinilla saastuneita alueita ovat erityisesti vanhojen sahanpohjien maaperä sekä Kymijoen pohjasedimentit. Tärkein altistuslähde ihmisellä on ruoka, Suomessa erityisesti Itämeren kala ja maitotuotteet. Koe-eläimillä TCDD on karsinogeeninen, teratogeeninen sekä immunotoksinen ja aiheuttaa akuutisti näivetyssyndrooman, maksavaurioita sekä entsyymi-induktion. Vuosikymmenien tutkimuksista huolimatta TCDD:n varsinainen vaikutusmekanismi on selvittämättä. Useimpien vaikutusten katsotaan välittyvän solulimassa olevan AH-reseptorin kautta. Se säätelee geenien ilmentymistä. Useimpien myrkyllisten vaikutusten mekanismeja ei kuitenkaan juuri tunneta. PPA-reseptorit säätelevät elimistön lipidi- ja glukoosimetaboliaa sekä solujen erilaistumista. Näiden reseptorien ligandeja ovat lukuisat rasvahapot sekä niiden johdannaiset, kuten monet eikosanoidit ja prostaglandiinit. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TCDD:n vaikutusta annoksella 50 μg/kg maksassa ekspressoituvien PPARα- ja PPARδ-reseptorien ekspressioon kahdessa dioksiiniherkkyydeltään erilaisessa rottakannassa in vivo. Samalla tarkasteltiin TCDD:llä voimakkaasti indusoituvan CYP1A1-entsyymin ekspressiota maksassa. Rottakannat valittiin siten, että niiden välillä oli hyvin suuri ero dioksiiniherkkyydessä. Käytetty TCDD-annos 50 μg/kg oli toiselle rottakannoista letaali ja toiselle subletaali annos. Dioksiinille herkässä rottakannassa vaikutuksia tarkasteltiin lisäksi subletaalilla TCDD-annoksella 5 μg/kg. Tutkittavista maksanäytteistä eristettiin RNA, joka muutettiin käänteiskopioijaentsyymin avulla komplementaariseksi cDNA:ksi käyttäen oligo dT -aluketta. Tämän jälkeen näytteiden sisältämä PPARα-, PPARδ- ja CYP1A1-reseptorien mRNA:n määrä tutkittiin valmistetusta cDNA:sta kvantitatiivisella PCR-menetelmällä käyttäen spesifisiä alukkeita. Mitattu mRNA:n määrä suhteutettiin β-aktiini-proteiinin mRNA:n määrään, jotta RNA:n määrän mittaamisessa ja näytteiden pipetoinnissa syntyneet erot eivät olisi vaikuttaneet saatuihin tuloksiin. TCDD:n havaittiin lisäävän huomattavasti CYP1A1-entsyymin ekspressiota maksassa sekä dioksiinia sietävän kannan että dioksiiniherkän kannan rotilla. Tämä annos on huomattavasti alhaisempi kuin dioksiinia sietävien rottien TCDD:n LD50, mutta selvästi korkeampi kuin dioksiiniherkkien rottien LD50. Tässä tutkimuksessa ei havaittu eroa tutkittavien rottakantojen välillä CYP1A1-entsyymin mRNA:n määrän lisääntymisessä. Dioksiineja sietäviltä rotilta löydetty AH-reseptorin muuttunut alleeli suojaa rottia hyvin kuolleisuudelta. Toisaalta eräissä TCDD:n vaikutuksissa, kuten CYP1A1-entsyymin aktiivisuuden lisääntymisessä ja kateenkorvan surkastumisessa, ei havaita eroa dioksiiniherkkyydeltään erilaisten rottakantojen välillä. Tässä tutkimuksessa kontrollirottien ja TCDD-altistettujen rottien välinen ero CYP1A1-entsyymin mRNA-määrien välillä maksassa oli yli 200 kertainen. CYP1A1-proteiinia koodaavan Cyp1a1-geenin toiminta on AH-reseptorin säätelemää. TCDD on AH-reseptoriin voimakkaimmin sitoutuva tunnettu yhdiste. TCDD-annosten 5 ja 50 μg/kg välillä ei havaittu vaikutusta CYP1A1-entsyymin ekspressiossa dioksiiniherkän-kannan rotilla, mikä on sopusoinnussa aiempien tulosten kanssa, jotka ovat osoittaneet jo annoksen 5 μg/kg aiheuttavan maksimaalisen entsyymi-induktion. Tässä tutkimuksessa PPARα- ja PPARδ-reseptorin ekspressio maksassa ei muuttunut TCDD-altistuksen jälkeen kummallakaan tutkittavista rottakannoista. Aikaisemmissa tutkimuksissa ei ole tarkasteltu TCDD:n vaikutusta PPA-reseptorien ekspressioon in vivo kuten tässä työssä tehtiin. Aikaisemmissa tutkimuksissa saatujen havaintojen perusteella olisi mielenkiintoista tutkia PPA-reseptorien ekspressiota in vivo rasvakudoksessa vastaavalla tavalla kuin tässä tutkimuksessa tutkittiin ekspressiota maksassa. Lisätutkimukset todennäköisesti osoittavatkin, onko TCDD:llä vaikutusta PPA-reseptorien ekspressioon rasvakudoksessa.

Background: Understanding the false negative rates of SARS-CoV-2 RT-PCR testing is pivotal for the management of the COVID-19 pandemic and it has implications for patient management. Our aim was to determine the real-life clinical sensitivity of SARS-CoV-2 RT-PCR. Methods: This population-based retrospective study was conducted in March–April 2020 in the Helsinki Capital Region, Finland. Adults who were clinically suspected of SARS-CoV-2 infection and underwent SARS-CoV-2 RT-PCR testing, with sufficient data in their medical records for grading of clinical suspicion were eligible. In addition to examining the first RTPCR test of repeat-tested individuals, we also used high clinical suspicion for COVID-19 as the reference standard for calculating the sensitivity of SARS-CoV-2 RT-PCR. Results: All 1,194 inpatients (mean [SD] age, 63.2 [18.3] years; 45.2% women) admitted to COVID-19 cohort wards during the study period were included. The outpatient cohort of 1,814 individuals (mean [SD] age, 45.4 [17.2] years; 69.1% women) was sampled from epidemiological line lists by systematic quasi-random sampling. The sensitivity (95% CI) for laboratory confirmed cases (repeat-tested patients) was 85.7% (81.5–89.1%) inpatients; 95.5% (92.2–97.5%) outpatients, 89.9% (88.2–92.1%) all. When also patients that were graded as high suspicion but never tested positive were included in the denominator, the sensitivity (95% CI) was: 67.5% (62.9–71.9%) inpatients; 34.9% (31.4– 38.5%) outpatients; 47.3% (44.4–50.3%) all. Conclusions: The clinical sensitivity of SARS-CoV-2 RT-PCR testing was only moderate at best. The relatively high false negative rates of SARS-CoV-2 RT-PCR testing need to be accounted for in clinical decision making, epidemiological interpretations, and when using RT-PCR as a reference for other tests.

Norovirus on merkittävä ruuansulatuskanavan patogeeni, joka aiheuttaa ihmisillä vuosittain infektioita ympäri maailman. Norovirukset voidaan jaotella kymmeneen eri genoryhmään, joissa on pääasiassa lajispesifisiä infektion aiheuttajia. Genoryhmän II norovirukset aiheuttavat infektioita sekä sioille että ihmisille, mutta pääasiassa sian ja ihmisen norovirukset ovat kuitenkin eri genotyyppejä. Mielenkiinnon on herättänyt kyseisten genotyyppien geneettinen samankaltaisuus ja norovirustestien lajispesifisyys, sillä joissakin tutkimuksissa on todettu ihmisen norovirustestin antaneen positiivisia tuloksia sian noroviruksille. Noroviruksen 15216-2-ISO-standardin mukaisen genoryhmän II PCR (eng. polymerase chain reaction)-testin tavoitteena on havaita noroviruksen genomi riskielintarvikkeista, kuten marjoista ja hedelmistä. Pääsääntöisesti testi on suunniteltu havaitsemaan ihmisten noroviruksia. Tässä alkuperäistutkimuksessa keskityttiin selvittämään noroviruksen 15216-2-ISO-standardin noroviruksen genoryhmän II mukaisten alukkeiden lajispesifisyyttä reaaliaikaisella RT-PCR (eng. reverse transcriptase polymerase chain reaction)-testillä, sillä aiempien tutkimuksien tulokset ovat herättäneet jatkotutkimuksen tarpeen. Ennen tutkimuksen tekoa uskoimme ristireaktioiden olevan mahdollisia genoryhmän II sian ja ihmisen koroviruksien samankaltaisen genomin vuoksi. Tutkimuksemme on tietääksemme ensimmäinen, jossa tutkitaan ihmisen genoryhmän II noroviruksille säädetyn 15216-2-ISO-standardin lajispesifisyyttä sian noroviruksen suhteen. Tutkimuksessa käytimme pakastettuja ja tuoreita sian ulostenäytteitä. Tutkimme yhteensä 100 testattavaa ulostenäytettä, yhden sian norovirukselle positiiviseksi todetun ulostenäytteen sekä 11 sian ulostetta sisältävää jätevesinäytettä. Teimme ulosteista ulostesuspensiot ja eristimme suspensioista RNA:ta kaupallisen eristyssarjan avulla. Tämän jälkeen monistimme näytteessä mahdollisesti olevaa noroviruksen RNA:ta DNA:na reaaliaikaisen käänteiskopioinnin ja polymeraasiketjureaktion avulla. Tutkimme näytteitä kahdessa erilaisissa testiolosuhteissa. 15216-2-ISO-standardin alukkeiden lisäksi testasimme positiivisen tuloksen antaneet ulostenäytteet ja kolme voimakkaimman tuloksen antanutta sian ulostenäytettä sisältävää jätevesinäytettä COG2R ja COG2F -alukkeilla. Saimme tutkimuksessamme 15216-2-ISO-standardin mukaisilla alukkeilla positiivisen tuloksen sian norovirukselle jo aiemmin sian norovirukselle positiiviseksi todetusta sian ulostenäytteestä. Lisäksi saimme positiivisia tuloksia seitsemästä muusta sian ulostenäytteestä ja yhdeksästä sian ulostetta sisältävistä jätevesinäytteistä kyseisillä alukkeilla. Kaikki seitsemän positiivisen tuloksen antanutta sian ulostenäytettä antoivat positiivisen tuloksen myös COG2R ja COG2F -alukkeilla. Kolme kyseisillä alukkeilla testaamaamme sian ulostetta sisältävää jätevesinäytettä antoivat positiivisen tuloksen. Tuloksemme tukevat ajatustamme siitä, että 15216-2-ISO-standardin mukainen RT-qPCR-testi havaitsee sian noroviruksia, sillä tutkimuksemme osoitti, että 15216-2-ISO-standardin mukainen RT-qPCR-testi voi antaa positiivisen tuloksen ainakin yhdelle sian noroviruksen genotyypille. Tutkimuksemme perusteella emme vielä osaa sanoa, antaako testi positiivisen tuloksen kaikille sian noroviruksen genoryhmän II genotyypeille, joten jatkotutkimuksissa positiivisen tuloksen antaneet näytteet sekvensoidaan tai muulla tavoin varmistetaan sian noroviruksiksi.

TCDD on voimakkain dioksiiniryhmän kemikaaleista. Dioksiinit ovat kaikkialla maapallolla esiintyviä ympäristösaasteita, jotka jo pieninäkin annoksina aiheuttavat monia biokemiallisia ja myrkyllisiä vaikutuksia selkärankaisissa. Dioksiinit ovat hyvin rasvaliukoisia, pysyviä ja elimistössä hitaasti hajoavia, minkä vuoksi ne kulkeutuvat elimistössä rasvakudokseen ja kertyvät ravintoketjussa. 1960-1970-luvuilla käytetyissä klooratuissa kemikaaleissa dioksiineja oli paljon epäpuhtauksina. Nykyään tärkeimmät dioksiinilähteet ovat jätteenpoltto ja muut polttoprosessit, metalliteollisuus ja aiemmin dioksiineilla saastuneet alueet. Suomessa dioksiinilla saastuneita alueita ovat erityisesti vanhojen sahanpohjien maaperä sekä Kymijoen pohjasedimentit. Tärkein altistuslähde ihmisellä on ruoka, Suomessa erityisesti Itämeren kala ja maitotuotteet. Koe-eläimillä TCDD on karsinogeeninen, teratogeeninen sekä immunotoksinen ja aiheuttaa akuutisti näivetyssyndrooman, maksavaurioita sekä entsyymi-induktion. Vuosikymmenien tutkimuksista huolimatta TCDD:n varsinainen vaikutusmekanismi on selvittämättä. Useimpien vaikutusten katsotaan välittyvän solulimassa olevan AH-reseptorin kautta. Se säätelee geenien ilmentymistä. Useimpien myrkyllisten vaikutusten mekanismeja ei kuitenkaan juuri tunneta. PPA-reseptorit säätelevät elimistön lipidi- ja glukoosimetaboliaa sekä solujen erilaistumista. Näiden reseptorien ligandeja ovat lukuisat rasvahapot sekä niiden johdannaiset, kuten monet eikosanoidit ja prostaglandiinit. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TCDD:n vaikutusta annoksella 50 μg/kg maksassa ekspressoituvien PPARα- ja PPARδ-reseptorien ekspressioon kahdessa dioksiiniherkkyydeltään erilaisessa rottakannassa in vivo. Samalla tarkasteltiin TCDD:llä voimakkaasti indusoituvan CYP1A1-entsyymin ekspressiota maksassa. Rottakannat valittiin siten, että niiden välillä oli hyvin suuri ero dioksiiniherkkyydessä. Käytetty TCDD-annos 50 μg/kg oli toiselle rottakannoista letaali ja toiselle subletaali annos. Dioksiinille herkässä rottakannassa vaikutuksia tarkasteltiin lisäksi subletaalilla TCDD-annoksella 5 μg/kg. Tutkittavista maksanäytteistä eristettiin RNA, joka muutettiin käänteiskopioijaentsyymin avulla komplementaariseksi cDNA:ksi käyttäen oligo dT -aluketta. Tämän jälkeen näytteiden sisältämä PPARα-, PPARδ- ja CYP1A1-reseptorien mRNA:n määrä tutkittiin valmistetusta cDNA:sta kvantitatiivisella PCR-menetelmällä käyttäen spesifisiä alukkeita. Mitattu mRNA:n määrä suhteutettiin β-aktiini-proteiinin mRNA:n määrään, jotta RNA:n määrän mittaamisessa ja näytteiden pipetoinnissa syntyneet erot eivät olisi vaikuttaneet saatuihin tuloksiin. TCDD:n havaittiin lisäävän huomattavasti CYP1A1-entsyymin ekspressiota maksassa sekä dioksiinia sietävän kannan että dioksiiniherkän kannan rotilla. Tämä annos on huomattavasti alhaisempi kuin dioksiinia sietävien rottien TCDD:n LD50, mutta selvästi korkeampi kuin dioksiiniherkkien rottien LD50. Tässä tutkimuksessa ei havaittu eroa tutkittavien rottakantojen välillä CYP1A1-entsyymin mRNA:n määrän lisääntymisessä. Dioksiineja sietäviltä rotilta löydetty AH-reseptorin muuttunut alleeli suojaa rottia hyvin kuolleisuudelta. Toisaalta eräissä TCDD:n vaikutuksissa, kuten CYP1A1-entsyymin aktiivisuuden lisääntymisessä ja kateenkorvan surkastumisessa, ei havaita eroa dioksiiniherkkyydeltään erilaisten rottakantojen välillä. Tässä tutkimuksessa kontrollirottien ja TCDD-altistettujen rottien välinen ero CYP1A1-entsyymin mRNA-määrien välillä maksassa oli yli 200 kertainen. CYP1A1-proteiinia koodaavan Cyp1a1-geenin toiminta on AH-reseptorin säätelemää. TCDD on AH-reseptoriin voimakkaimmin sitoutuva tunnettu yhdiste. TCDD-annosten 5 ja 50 μg/kg välillä ei havaittu vaikutusta CYP1A1-entsyymin ekspressiossa dioksiiniherkän-kannan rotilla, mikä on sopusoinnussa aiempien tulosten kanssa, jotka ovat osoittaneet jo annoksen 5 μg/kg aiheuttavan maksimaalisen entsyymi-induktion. Tässä tutkimuksessa PPARα- ja PPARδ-reseptorin ekspressio maksassa ei muuttunut TCDD-altistuksen jälkeen kummallakaan tutkittavista rottakannoista. Aikaisemmissa tutkimuksissa ei ole tarkasteltu TCDD:n vaikutusta PPA-reseptorien ekspressioon in vivo kuten tässä työssä tehtiin. Aikaisemmissa tutkimuksissa saatujen havaintojen perusteella olisi mielenkiintoista tutkia PPA-reseptorien ekspressiota in vivo rasvakudoksessa vastaavalla tavalla kuin tässä tutkimuksessa tutkittiin ekspressiota maksassa. Lisätutkimukset todennäköisesti osoittavatkin, onko TCDD:llä vaikutusta PPA-reseptorien ekspressioon rasvakudoksessa.