Browsing by discipline "Mikrobiologia"

Human gut microbiota is an important topic for many different disciplines. Various factors, e.g. antimicrobial drugs and diet, affect the development and balance of gut microbiota and its interactions with the host. Plant based carbohydrates that transit unabsorbed and undigested through the upper parts of gastrointestinal tract are an important source of energy for the colon bacteria. Some of colon bacteria produce short chained fatty acids (e.g. acetate, propionate, butyrate) from these carbohydrates. SCFAs provide a source of energy and regulate the cell growth and metabolism. The changes in the diversity and abundance of the SCFA producing bacteria have been linked to many gut related diseases. Studying gut microbiota with today’s analytical methods is still challenging. In this work the effects of dietary fibers on gut microbiota were monitored with a static, single vessel batch model. A batch model is typically developed for the quick high-throughput screening of samples. Fiber samples were processed in various ways to increase their solubility and thus fermentability. In this work butyrate producing bacteria, Akkermansia muciniphila and bifidobacteria were targeted. Enumeration was performed with selective growth media and quantitative PCR. Bacterial population was characterized by 16S rRNA based sequencing. To quantitate only viable bacterial cells from the sample matrix by qPCR, samples were treated with propidium monoazide (PMA), which after light activation inhibits the amplification of double-stranded DNA from dead and lysed cells. Since acidic SCFAs accumulate in the sample suspension, pH decreases clearly during the incubation in the static model. This leads to conditions which do not resemble the ones in the colon. Two different buffer solutions, pH adjustment and shorter incubation time were tested to overcome this challenge. The numbers of A. muciniphila and some of the butyrate producers decreased in acidic environment and the proportion of acid-tolerant bacteria was clearly increased and dominated the bacterial population. The optimization of PMA treatment for fecal suspension samples proved to be challenging due to the highly variable composition of sample matrixes. Dietary fibers were observed to cause different changes in bacterial population: the most soluble fibers caused greater decrease of pH and thus greater proportion of acid tolerant bacteria in the population.

Inorganic phosphate (Pi) is the only readily utilizable form of phosphorus for toxic diazotrophic cyanobacterium Nodularia spumigena (N. spumigena). Pi is one of the limiting nutrients in the Baltic Sea where surprisingly N. spumigena are highly abundant especially during the summer. This indicates that N. spumigena possibly has an alternative pathway to fulfill its phosphorus requirement. The Baltic Sea, like most aquatic environments, is enriched with organic phosphorus compounds among which phosphonates may constitute a significant fraction. Interestingly, the Baltic Sea N. spumigena strains UHCC 0039 and CCY9414 have been found to carry phosphonate degrading gene cluster (phnC-M) implying that these cyanobacteria could assimilate phosphonates as a phosphorus source. However, the significance of the presence of phn gene cluster in N. spumigena for phosphonate utilization has not been investigated in detail. Here, I aimed to understand how N. spumigena copes with Pi limitation and utilizes phosphonates in laboratory conditions using biochemical assays, PCR-based methods and bioinformatics tools. This would aid in finding a suitable marker for Pi deficiency in cyanobacterial blooms in the Baltic Sea. In this study, bioinformatics and PCR screening showed that phn gene cluster was conserved in the Baltic Sea N. spumigena strains. The studied N. spumigena strains UHCC 0039 and UHCC 0060 were found to utilize naturally produced low molecular weight phosphonates, methylphosphonate (MPn), ethylphosphonate (EPn) and 2-aminoethylphosphonate (2APn). Among these phosphonates, MPn seemed to be the most preferred phosphorus source. Alkaline phosphatase activity, an indicator of Pi limitation, was found to be elevated in the media with Pi and 2APn questioning its suitability as a marker for phosphorus limitation. In addition, growth on MPn released methane indicating that massive blooms of N. spumigena might contribute to an elevated methane supersaturation in the Baltic Sea. Reverse transcriptase quantitative PCR (RT-qPCR) in N. spumigena strains did not show expected upregulation of high-affinity phosphate transporter pstS in Pi limitation. It demonstrated an induction of phosphonate transporter gene phnD in media lacking Pi and supplemented by 2APn. The phosphonate lyase gene phnJ was however, upregulated only in the presence of MPn suggesting that phnJ gene could be used as a marker for phosphonate bioavailability. The findings from this study suggest that the presence of phn gene cluster could provide N. spumigena a competitive advantage in Pi-limited cyanobacterial blooms in the Baltic Sea. The molecular detection methods designed in this study thus could be used in future to monitor the expression of genes induced during Pi limitation and the presence of phosphonates, and the method could be further optimized for screening natural water samples.

The Baltic Sea is one of the most extensive oxygen-depleted (hypoxic) areas. The hypoxic areas in the Baltic Sea are becoming more common due to climate change and anthropogenic eutrophication. The influence of hypoxia on sediment communities is in general well known, but the impact of different degrees of hypoxic stress on the functions of benthic microbial communities is less studied. Although the impact of microbes on benthic ecosystem functioning can be significant, the changes caused by hypoxia disturbed microbial communities are not well known. These changes can affect other organisms and environment globally because microbes influence nutrient and element cycles. Also some microbial species produce toxic hydrogen sulfide (H2S) in anaerobic conditions. This study investigated sandy sediments taken from the Baltic Sea whose organism communities were artificially disturbed by covering sediment plots with oxygen impermeable plastic sheets. Covering induced artificially hypoxia (< 2 ml O2 l-1) of different durations for 0, 3, 7 and 48 days. This thesis concentrated studying the bacterial communities of the disturbed sediments. Change in bacterial community was observed by terminal restriction fragment length polymorphism analysis (T-RFLP). The aim was find out how bacterial community composition and diversity changed in sediments influenced by increasing hypoxic disturbance. The conducted observations indicated how changes within the bacterial community can influence other organisms and environment. Results obtained by permutational ANOVA testing indicated that bacterial community composition, especially bacterial biodiversity, was influenced by artificially induced hypoxia lasting 48 days. A slight decrease in bacterial diversity was seen already after 7 days hypoxia. Overall bacterial community was more resistant to disturbance than animal fauna, which has been studied in parallel research (Villnäs ym. 2012). H2S-producing deltaproteobacteria (e.g. Desulfatiferula, Desulfovibrio and Desulfofustis) were observed in sediments which were disturbed the longest, which explains the H2S production detected in chemical data of the parallel study. This may have caused a decrease in macrofauna. Amounts of sulfate-reducing bacteria correlated with increases in ammonium and silicate, which may increase both eutrophication and anoxia in an aquatic system. Results indicated that bacterial community was disturbed due to increasing hypoxia, and changes in the bacterial community correlated with changes in chemical parameters. Observations suggest that changes in the composition of a bacterial community may influence an entire ecosystem. The composition of microbial communities should be taken into account when studying the impact of environmental disturbances on various ecosystems.

Alphaviruses are single-stranded positive-sense RNA viruses that have been the cause of numerous epidemics in the past decades. The viral genome codes four nonstructural proteins that are associated with viral RNA replication. The translation product is a polyprotein from which the individual nonstructural proteins are cleaved. The genome is transcribed by the nonstructural proteins to produce a negative strand, which acts as a template in the synthesis of positive strands. The subgenomic RNA, which codes the structural proteins, is transcribed from the negative template strand. The replication of genomic and subgenomic RNA strands is associated with replication complexes composed of the nonstructural proteins. The replication complexes are housed in membrane invaginations called spherules on the plasma membrane and endolysosomal vesicles. Transfection of plasmids expressing viral replicase proteins and template RNA can also induce formation of replication complexes in addition to live virus infection. Purification of the replication complexes is necessary for detailed functional and structural analysis. In this work, two methods were used in the purification of replication complexes. In the first method, mammalian cells were infected with viruses and replication complexes were blocked on the plasma membrane by drug treatment to prevent transport to endolysosomal vesicles. Cells were lysed and nuclei were removed by centrifugation. The postnuclear supernatant was sedimented by ultracentrifugation in a discontinuous gradient. The gradient was fractionated and the fraction containing the replication complexes was subjected to equilibrium ultracentrifugation to separate particles by density. The fraction containing the replication complexes was studied using electron microscope, and protein and lipid analysis. In the second method, mammalian cells were transfected with plasmids expressing a template RNA and the viral polyprotein to induce formation of replication complexes. A sequence coding hemagglutinin peptide had been inserted into the polyprotein sequence coding for the nonstructural protein with polymerase activity. Cells were lysed and nuclei were removed. Rreplication complexes were immunocaptured using the hemagglutinin tag by subjecting the supernatant to anti-HA agarose beads. Captured replication complexes were eluted with Laemmli sample buffer and purification was examined using Western blotting. Spherules associated with replication complexes were observed using electron microscope and the presence of nonstructural proteins was confirmed with antibodies. Spherules were observed in low numbers and Western blotting revealed that samples contained cellular contaminants. Purification of replication complexes using immunocapture was very low, but more than that of untagged samples. Although significant purification of replication complexes was not achieved, progress was made in the optimization of the methods.

Työn tarkoituksena oli pystyttää reaaliaikainen PCR-menetelmä enterohemorraagisten Escherichia coli (EHEC) seroryhmien O26, O55, O91, O111, O113, O145 ja O157 sekä H7-antigeenin ja virulenssigeenien stx1, stx2 ja hlyA nopeampaa havaitsemista varten. Työssä testattiin menetelmän soveltuvuutta EHEC-bakteerien havaitsemiseen 45 puhdasviljelmäkannan lisäksi myös seitsemästä sekaviljelmästä, joista yksi oli Nokian vesiepidemian vesinäyte. Puhdasviljelmäkannat ja kuusi muuta sekaviljelmää olivat peräisin sairaaloista vuosien 1996-2007 välisenä aikana lähetetyiltä sekaviljelmämaljoilta. EHEC-bakteerit kuuluvat suolistotulehduksia aiheuttaviin E. coli-bakteereihin. Ne ovat suolistotulehduksia aiheuttavista E. coli-ryhmistä tärkein elintarvikevälitteisten ripulien aiheuttaja Suomessa ja muissa länsimaissa. EHEC-bakteerit leviävät pääasiallisesti elintarvikkeiden ja juomaveden kautta, vaikkakin alkuperäinen kontaminaatio on aina saanut alkunsa ihmisen tai eläimen ulosteesta. EHEC-infektion voi saada jo 10–100 bakteerista ja sen onkin todettu tarttuneen ihmisestä toiseen. Bakteerin tärkein reservuaari on nautakarjan ja muiden märehtijöiden suolistossa. EHEC-infektioita tavataan yleensä n. 10–20 tapausta vuosittain Suomessa. Suomessa, kuin myös maailmanlaajuisesti, yleisin epidemioita aiheuttanut EHEC-kanta on tähän mennessä kuulunut O157:H7-serotyyppiin. Muita tärkeitä epidemioita aiheuttaneita O-seroryhmiä Suomessa ja muualla maailmalla ovat olleet seroryhmät O26, O103, O111 ja O145. EHEC-bakteeri aiheuttaa vesiripulia, mutta potilaat voivat kärsiä myös vatsakivuista ja oksentelusta. Osalla ihmisistä vesiripuli voi muuttua myös veriripuliksi (Hemorragic Colitis, HC). Jotkut voivat olla myös oireettomia kantajia. EHEC-bakteerin aiheuttama ripuli voi kehittyä hemolyyttis ureeminen oireyhtymä (haemoltyic uremic syndrome, HUS- jälkitaudiksi, jonka oireina ovat akuutit munuaisvaurioit, mikroangiopaattinen hemolyyttinen anemia ja trombosytopenia. Aikuisilla voi esiintyä myös HUS:n tromboottiseksi trombosytopeeniseksi purppuraksi (trombotic trombocytopenic purpura, TTP) kutsuttua muotoa. HUS:n riskiryhmään kuuluvat alle viisivuotiaat lapset ja vanhukset. EHEC-bakteerin aiheuttama tauti luokitellaan Suomessa yleisvaarallisiin tartuntatauteihin. EHEC-bakteerin virulenssitekijöihin lukeutuu shigatoksiinin tuottogeenien (stx1- ja stx2-geenit) lisäksi myös Enterohemolysiinin tuottogeeni (hly-geeni) ja LEE (Locus of Enterocyte Effacement)-patogeenisuus saareke, joka sisältää mm. tir- ja eae-geenit, jotka määräävät proteiineja, joiden välityksellä EHEC-bakteeri kiinnittyy suolen epiteeliin. Shigatoksiineja pidetään oireiden pääasiallisena aiheuttajana. Tässä työssä testattu reaaliaikainen PCR-menetelmä (Real-Time PCR) on uusimpia EHEC-bakteerin tunnistamiseen käytetyistä menetelmistä. Menetelmä hyödyntää fluoresoivia koettimia, jotka toimivat fluoresenssi resonanssilla eli energian siirtymisellä (Fluorescense Resonance Energy Transfer, FRET) kahden fluoresoivan leiman kesken. Menetelmä mahdollistaa PCR-tuotteen analysoimisen monistamisen yhteydessä ja vähentää analysoimisen aikana syntyvän kontaminaatioriskin lisäksi myös turvallisuusriskiä, kun tulosten visualisoinnissa ei tarvitse käyttää karsinogeenista Etidiumbromidia (EtBr). Tässä työssä menetelmällä saadut tulokset olivat toistettavia ja vastasivat aiemmin monialukkeisella PCRmenetelmällä ja agglutinaatiotekniikalla saatuja tuloksia. Sekaviljelmiä testatessa reaaliaikaisen PCR-menetelmän kanssa samanaikaisesti rinnakkain tehty monialukkeinen PCR-menetelmä antoi myös yhtenevät tulokset. Reaaliaikainen PCR-menetelmä osoittautui monialukkeista PCR-menetelmää ja agglutinaatiotekniikkaa huomattavasti nopeammaksi menetelmäksi, joka mahdollistaa nopeamman diagnoosin, joka on tärkeää HUS-jälkitautia sairastavien potilaiden hoidon kannalta.

Diverse ecological interactions between populations have a considerable impact on the composition and evolution of microbial communities. Microbial evolution can happen in such short timescales that the evolutionary and coevolutionary events occurring in the populations, in turn, affect the ecological interactions in the communities. Predation and competition are the two most important factors affecting the composition and evolution of microbial communities, and usually they are strongly dependent on each other. The aim of this work was to study the effects of a predatory ciliate, Tetrahymena thermophila, on the composition and activity of a synthetic bacterial community, and to compare the differences between the effects of an ancestral strain and a coevolved strain that had previously coevolved with Pseudomonas fluorescens SBW25. Another aim of this study was to examine whether the rapidly evolving P. fluorescens bacterial strain has any definitive impact on the composition of the synthetic multi-strain bacterial community, and what are the differences between the effects of ancestral, evolved and coevolved populations of the bacterium. The effects of the different treatments were studied by measuring bacterial and ciliate population densities and community activity, and with 16S rRNA gene sequence analysis of different timepoints in the experiment. Predation had a significant effect on community composition, activity and bacterial population densities. The effect of the coevolved predator on the community composition was weaker than the effect of the ancestral predator, which was most likely caused by the smaller population density of the coevolved predator. Possibly because of this, there was no significant difference in community activity, diversity or bacterial population densities between the predator treatments. Thus, for this part, the results were consistent. P. fluorescens had a small effect on the community composition, and the difference in the evolutionary history of the P. fluorescens populations had a significant effect on the metabolic activity of the community. The experimental results indicated that prior coevolution between P. fluorescens and T. thermophila can have possible notable effects on the composition and metabolic activity of a bacterial community. The impact of earlier evolutionary adaptation or possible coevolution between community parties should be taken into consideration when studying ecological interactions and evolutionary changes in microbial communities.

Terveellä eläimellä on ruuansulatuskanavassa monimuotoinen mikrobisto, jonka tasapainoon vaikuttavat elinympäristön olosuhteet ja isäntäeläimestä johtuvat tekijät kuten ruuansulatuskanavan pH, peristaltiikka ja käytettävissä olevat ravinteet. Suolistomikrobiston kehittyminen alkaa porsaan syntymisen yhteydessä ja jatkuu koko eliniän. Suolistomikrobiston tasapainolle porsaan vieroitus on suuri muutos, jolloin helposti esiintyy häiriöitä mikrobiston tasapainossa. Suolistomikrobisto stimuloi immuunijärjestelmän ja suolen limakalvon kehittymistä sekä limakalvon limantuotantoa. Toimivan suolistomikrobiston on havaittu suojelevan isäntäeläintä patogeenien mikrobien infektioilta. Probiooteilla pyritään tasapainottamaan suoliston mikrobistoa ja siten ehkäisemään suolistoinfektioita. Probioottien on raportoitu lisäävän kasvua, vähentävän kuolleisuutta ja estävän ripulin esiintymistä. Tässä syventävien opintojen tutkielmassa tutkittiin sian suolistosta eristettyjen maitohappobakteerien antimikrobisia ominaisuuksia. Tavoitteena oli selvittää, voidaanko vieroitusripulia ja ödeematautia aiheuttavan E. coli -bakteerin kasvua inhiboida in vitro sian suolistosta tai ulosteesta eristettyjen maitohappobakteerien antimikrobisten ominaisuuksien avulla. Menetelmänä käytettiin Bioscreen®-kasvatusta, jota varten testikannoista tehtiin kasvusuodokset. Bioscreen®-kasvatuksen avulla selvitettiin, aiheuttaako maitohappobakteerin kasvusuodos patogeenin E. colin kasvun inhiboitumista in vitro. Maitohappobakteerien maitohapon tuoton ja kasvualustan pH:n vaikutuksia kontrolloitiin vastaavasti maito- ja suolahapolla. Tuloksena kahden vuorokauden kasvatuksissa havaittiin jo pelkän pH:n laskun aiheuttavan indikaattoribakteerin kasvun estymistä. Suurin osa 139 testibakteerikannasta esti E. coli -indikaattoribakteerin kasvua vaihtelevasti. E. coli -bakteerin kasvun estymistä testibakteerien kasvusuodosta sisältävällä alustalla verrattiin maitohapon aiheuttamaan kasvunestoon. Voimakkaasti (yli 20 % maitohappoa enemmän) E. coli -bakteerin kasvua estäviä bakteerikantoja oli kolme. Voimakkaasti kasvua estävien testibakteerien kasvunesto positiiviseen kontrolliin verrattuna oli 31-39 %. Suurin osa (102 isolaattia) testikannoista esti indikaattoribakteerin kasvua 0-10 % maitohappoa enemmän. Johtopäätöksenä voidaan todeta, että 139 testatusta maitohappobakteerikannasta tässä tutkimuksessa kolmen kannan kasvusuodoksella on indikaattoribakteeri E. coli O141 F18-kannan kasvua voimakkaasti inhiboiva vaikutus in vitro. Tulokset viittaavat siihen, että ainakin kyseiset kolme kantaa voivat tuottaa maitohapon lisäksi antimikrobisia yhdisteitä, joiden luonnetta tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan voitu tarkemmin selvittää. Näiden antimikrobisilta ominaisuuksiltaan parhaimpien Lactobacillus-kantojen käytettävyys probiootteina ja mahdollisina rokotevektoreina edellyttää myös lisätutkimuksia sekä in vitro että in vivo kokeina.

Mykobakteerit ovat ehdottoman aerobeja haponkestäviä sauvoja, joiden muoto, optimikasvulämpötila, kasvunopeus ja taudinaiheutuskyky vaihtelevat suuresti. Suvun tyyppikanta on Mycobacterium tuberculosis. Mykobakteerit infektoivat eläimiä ja ihmisiä. Ihmisille vaarallisin on Mycobacterium tuberculosis , eläimille M. bovis ja M. avium - kompleksin kannat. Maailmassa sairastuu tuberkuloosiin 2 milj. ihmistä ja satoja tuhansia mykobakteerien saastuttamia eläimiä tuhotaan vuosittain. Suomessa uusia tuberkuloositapauksia todetaan noin 400 vuodessa. Mykobakteerien aiheuttamat taudit ovat pääasiallisesti hitaasti eteneviä tauteja, jotka johtavat sairastuneen ihmisen tai eläimen kunnon heikkenemiseen ja lopulta kuolemaan ilman asianmukaista hoitoa. Suomen lähialueilla tavataan runsaasti myös lääkkeille moniresistenttejä M. tuberculosis-kantoja. Eläinten infektiot ovat Suomessa pääsääntöisesti M. avium:in aiheuttamia sikojen infektioita, mutta muualla maailmassa myös nautatuberkuloosia aiheuttava M. bovis ja Johnen tautia aiheuttava M. avium sp. paratuberculosis ovat tärkeitä taudinaiheuttajia erityisesti märehtijöille. Suomi on virallisesti nautatuberkuloosista vapaa maa. Tautitilannetta seurataan erityisesti lihantarkastuksen yhteydessä ja keinosiemennyssonnien terveysvalvontaohjelmassa. Suomessa luonnonolot ovat sellaiset, että ympäristömykobakteereja esiintyy paljon. Esimerkiksi suot ovat mykobakteereille sopivia kasvupaikkoja, koska mykobakteerit kasvavat happamissa olosuhteissa. Tutkimusosassa käsitellään mykobakteerien eristystä lihasikojen elinnäytteistä ja mykobakteerien tunnistusta. Tutkimuksen tarkoitus oli kerätä mahdollisimman paljon kantoja ja tunnistaa ne laji- ja kantatasolle yhteistyössä Kansanterveyslaitoksen mykobakteerireferenssilaboratorion kanssa. Kaikista näytteistä kasvoi ainakin yksi mykobakteerikanta. Joissain tapauksissa kantoja oli useampia. Kaikki PCR-positiiviset kannat olivat M. avium -kompleksin kantoja. Tulosten valossa voidaan olettaa, että lihantarkastuksessa hylätyt ruhot todella ovat mykobakteerien infektoimia ja pääsääntöisesti infektio on M. avium –bakteerin aiheuttama. Lisätutkimusta tarvitaan erityisesti eläinten ja ihmisten epidemiologian selvittämiseksi ja tartuntojen ehkäisemiseksi jatkossa.

Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) can cause diarrheal disease in humans. Like commensal E. coli, DEC are present in the human and mammalian, especially ruminant, and avian gut. They can also be present in soil and water environments. The food of animal origin can act as a transmission vehicle to infect humans. Infection may also be gained by drinking water contaminated by animal or human feces. DEC can be devided into five pathogroups based on their virulence traits: enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC). EPEC typically causes children’s diarrhea in developing countries. ETEC is a typical cause for tourist’s diarrhea and infantil diarrhoea in developing countries. EHEC causes bloody or non-bloody diarrhea that might lead to kidney dysfunction called hemolytic uremic syndrome (HUS) especially in young children. EIEC causes Shigella-like diarrhea which can be bloody. EAEC is mainly associated with prolonged diarrhea. This study was conducted to find out the prevalence of diarrheagenic E. coli in humans and food in Burkina Faso, on which there was no previous knowledge. Fecal samples were collected from children under five years of age suffering from diarrhea in two villages, Boromo and Gourcy, and in the capital Ouagadougou (110 samples). Raw meat samples (chicken, beef, mutton and bovine intestines used for human consumption) were collected from open markets in Ouagadougou (120 samples). Primary mixed bacterial cultures obtained from the samples were studied using multiplex PCR-method, which detects the virulence genes of the five pathogroups. In addition, 20 EHEC strains were isolated from meat samples using colony hybridization based on the detection of Shiga toxin gene stx and PCR-screening, and were characterized to reveal the possible virulence properties. The study demonstrated that DEC-infections in small children are common in Burkina Faso. Of the studied fecal samples, 59 % were positive for DEC. The most prevalent pathogroups were EAEC (32 %), ETEC (31 %) and EPEC (20 %). EIEC (2 %) and EHEC (1 %) were found only in a few samples. Mixed infections with more than one pathogroup were common (24 %). The difference in DEC prevalence between the different sampling locations was statistically significant. There were more DEC-infections in Gourcy than in Ouagadougou and Boromo. The study also showed that DEC occur commonly in raw meats sold at open markets in Ouagadougou. Of the studied meat samples, 43 % were positive for DEC. The most prevalent were EHEC (28 %), EPEC (20 %), ETEC (8 %) and EAEC (5 %). EIEC was not detected. Mixed contaminations with more than one pathogroup were relatively common (17 %) in meat. There was no statistical significance in DEC-prevalence between the different meats. When prevalence was considered by each pathogroup, EHEC was absent in chicken and the difference was statistically significant when compared to the other meats. The 20 EHEC strains isolated from the meat samples were grouped into 14 serotypes, some of which have previously been isolated from humans suffering from diarrheal disease and HUS. All the strains were positive for stx1 and half of them also for stx2, which is considered to be the more virulent form of Shiga toxin. Two EHEC strains were also positive for an ETEC-related gene of heat-stable enterotoxin Ia. Hence, the two strains were a mixture of two pathogroups and an evidence of gene transfer between different pathogroups. The youngest children do not consume meat but meat can be thought to represent a sample from their living environment, because food for children might be prepared in the same environment where raw meat products are handled. Thus contaminated meat can be a source of DEC-infections in little children.

Salmonella- ja kampylobakteerit ovat maailmanlaajuisesti yleisimpiä elintarvikevälitteisiä patogeenejä sekä gastroenteriitin aiheuttajia ja niitä esiintyy yleisesti siipikarjassa. Lukuisissa tutkimuksissa on selvitetty näiden bakteereiden esiintyvyyttä ja siirtymisteitä elintarvikeketjussa ja sen perusteella kehitetty toimenpiteitä niiden kontrolloimiseksi. Tässä työssä tutkittiin kampylobakteereiden ja salmonellan esiintymistä 302 riistalinnun ulostenäytteessä (102 fasaanin, 70 sinisorsan, 30 tavin ja 100 sepelkyyhkyn) fenotyyppiin (ilmiasuun) sekä genotyyppiin (perimään) perustuvilla menetelmillä. Fenotyyppisiä menetelmiä olivat bakteereiden rikastus ja viljely sekä biokemialliset testit ja mikrobilääkeherkkyys, genotyyppisiä taas reaaliaikainen PCR sekä pulssikenttägeelielektroforeesi (PFGE). Tutkimuksessa arvioitiin kaikkiaan kahdeksan alukeparin ja kahden koettimen toimivuutta bakteereiden tunnistamisessa näytteestä eristetystä DNA:sta reaaliaikaisella PCR –menetelmällä pohjautuen sekä SYBR Green- että TaqMan –tekniikkaan. SYBR Green –tekniikkaan perustuvassa menetelmässä kampylobakteereiden tunnistukseen käytettiin viittä ja salmonellalle kolmea alukeparia, ja näillä alukkeilla saadut positiiviset näytteet varmistettiin sekä salmonellan että kampylobakteereiden suhteen kahteen TaqMan –koettimeen ja –alukepariin perustuvalla menetelmällä. Lopuksi reaaliaikaisen PCR:n eri ajo-olosuhteiden sekä käytettyjen reagenssien välisiä eroja verrattiin määrittämällä reaktioiden monistumistehokkuus standardisuorien avulla. Lisäksi osa bakteereista karakterisoitiin PFGE:llä ja biokemiallisilla testeillä sekä määritettiin niiden mikrobilääkeherkkyys. Työ tehtiin Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan elintarvikehygienian ja ympäristöterveyden osastolla. Kaikki tutkitut ulostenäytteet olivat peräisin tarhalla kasvatettavista riistalinnuista, joita esiintyy Suomessa myös luonnonvaraisina. Reaaliaikaisen PCR:n tulosten perusteella kampylobakteereita esiintyi eniten sorsalintujen ulostenäytteissä (näytteistä lähes 80 % oli 16S rRNA:n monistumisen perusteella SYBR Green –tekniikalla positiivisia), kun taas sepelkyyhkyissä (25 % näytteistä oli positiivisia) ja fasaaneissa (lähes 20 % näytteistä oli positiivisia) paljon vähemmän. Salmonellan suhteen kaikki näytteet olivat negatiivisia. TaqMan – tekniikkaan perustuva reaaliaikainen PCR – menetelmä osoittautui SYBR Green – menetelmää luotettavammaksi bakteereiden tunnistuksen suhteen, koska osa jälkimmäisellä menetelmällä testatuista positiivisista näytteistä oli TaqMan – menetelmällä negatiivisia. Standardisuorien perusteella reaktioiden tehokkuuksien välillä ei ollut merkittävää eroa. Pulssikenttägeelielektroforeesin tuloksena SmaI – restriktioentsyymillä saatiin tyypitettyä 18 kampylobakteerikantaa, jotka kuuluivat kaikki samaan genotyyppiin.