Browsing by Author "Röpelinen, Riina"

Clostridium botulinumin tuottama hermomyrkky botuliinitoksiini aiheuttaa hengenvaarallisen halvaustilan eli botulismin ihmisille ja eläimille. Sekä botuliinitoksiinit että niitä tuottavat bakteerikannat ovat hyvin monimuotoisia. Tyypillisesti kukin C. botulinum -kanta tuottaa yhtä seitsemästä botuliinitoksiinin serotyypistä (A-G), mutta C. botulinum -ryhmässä I esiintyy myös kahta toksiinityyppiä tuottavia bakteerikantoja. Tutkimamme suomalaisesta imeväisbotulismitapauksesta eristetty C. botulinum Bf -kanta ilmentää toksiinityyppejä B ja F koodaavia geenejä. C. botulinum Bf -kantoja on eristetty useista imeväisiän botulismitapauksista ympäri maailmaa ja niiden tiedetään tuottavan pääasiassa B-toksiinia 37 °C:n lämpötilassa ja F-toksiinia 30 °C:n lämpötilassa. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, miten C. botulinum Bf -kanta kasvaa, tuottaa itiöitä ja ilmentää kahta toksiinigeeniään eri kasvulämpötiloissa. Oletimme lämpötilan vaikuttavan merkittävästi bakteeripopulaatioiden kasvutehokkuuteen ja itiöiden muodostukseen sekä säätelevän osaltaan toksiinigeenien ilmentymisprofiileja. Toksiinigeeniaktiivisuutta säätelevien tekijöiden tutkiminen voi sekä valaista kahta toksiinia tuottavien bakteerikantojen alkuperää että antaa elintarviketeollisuudelle ja lääketieteelle tärkeää tietoa C. botulinumin toksiinituotannon säätelystä. Tutkimamme C. botulinum Bf -kannan bakteereja kasvatettiin TPGY-liemessä kolmessa eri lämpötilassa: 20 °C, 37 °C ja 42 °C. Kaikille bakteeriviljelmille muodostettiin kasvu- ja pH-käyrät. Lisäksi todennäköiset bakteerisolu- ja itiöpitoisuudet määritettiin eri kasvuvaiheissa. Viljelmien eri kasvuvaiheista kerättiin solunäytteet, joista eristetystä RNA:sta valmistettiin käänteiskopiointireaktion avulla cDNA:ta. RT-qPCR-analyysin avulla määritettiin toksiinigeenien botB ja botF ilmentymisprofiilit eri kasvuvaiheissa. Lämpötilan havaittiin vaikuttavan merkittävästi C. botulinum Bf -kannan kasvuun ja itiöintiin. Bakteerikanta kasvoi nopeimmin ja korkeimpaan kasvutiheyteen 37 °C:ssa. Lämpötilassa 20 °C kasvu oli huomattavasti hitaampaa, mutta tasaisempaa kuin 37 °C:ssa. Lämpötiloihin 20 °C ja 37 °C verrattuna 42 °C:n lämpötila inhiboi huomattavasti kasvua, itiöintiä ja happamien aineenvaihduntatuotteiden muodostusta. Toksiinigeeneillä havaittiin keskenään hyvin samankaltaiset, kasvukäyriä mukailevat ilmentymisprofiilit sekä 37 °C:ssa että 42 °C:ssa. Lämpötilassa 20 °C botB:n ilmentymisprofiili noudatti kasvutrendiä, mutta botF:n maksimaalinen aktiivisuus painottui poikkeuksellisesti vasta myöhäiseen stationaarivaiheeseen. Tulosten perusteella C. botulinum Bf -kannan metabolia on sopeutunut paremmin 20 °C:n ja 37 °C:n lämpötiloihin kuin 42 °C:n lämpötilaan. Tämä saattaa viitata bakteerikannan kehittyneen selviytymään niin nisäkkään ruumiinlämpötilassa 37 °C:ssa kuin ympäristön lämpötilassa. Toksiinigeenien keskenään samankaltaiset ilmentymisprofiilit 37 °C:ssa ja 42 °C:ssa viittaavat yhteisiin kasvuvaiheesta riippuviin säätelyreitteihin. Toisaalta botF:n poikkeava ilmentymisprofiili 20 °C:ssa saattaa selittyä toksiinigeeniklusterikohtaisella, lämpötilasta riippuvalla säätelymekanismilla. Kasvulämpötilan, toksiinigeeniaktiivisuuksien ja itiöinnin välille löydettiin useita hypoteettisia säätelyreittejä. Tutkimus toimii pohjana tuleville pyrkimyksille ymmärtää kahta toksiinia tuottavien C. botulinum -kantojen toksiinituotantoa ja sen säätelyä.