Browsing by Subject "modifikaatiot"

Ribonukleiinihapot (RNA) toimivat kriittisissä biologisissa tehtävissä geneettisen tiedon välittäjinä solun sisällä. Sen lisäksi niillä on merkittävä rooli perintöaineksen säilymisessä ja siirtymisessä sekä katalyyttisten toimintojen ylläpitämisessä. RNA-modifikaatioiden on katsottu toimivan ylimääräisenä tiedonvälittäjäkerroksena solufysiologian säätelemisessä nukleotidisekvenssien koodauksessa. Tämän Pro gradun kirjallisuusosassa esitellään viimeisten viiden vuoden ajalta (2014-2019) vakiintuneet tekniikat sekä ohjelmistot RNA-modifikaatioiden tutkimuksissa. RNA-modifikaatioiden monimuotoisten biologisten toimintojen selvittäminen perustuu tarkkaan detektointiin, kvantitointiin, ja modifikaatioiden kartoitukseen. Näytteen esikäsittely mm. kemiallinen leimaaminen on tärkeässä roolissa onnistuneen analyysin kannalta. Työssä kerrotaan mm. massaspektrometrisistä (MS) identifioinneista ja rakennetutkimuksista sekä sekvenssointtitekniikoiden hyödyntämisestä. Useiden viime vuosien aikana menetelmien kehittämisessä on edistytty merkittävästi. Erityisesti MS datan käsittelyyn soveltuvia ohjelmistoja on luotu tandemmassaspektrien tulkitsemiseksi. Massaspektrien käsittelyn monipuolistaminen on johtanut uusiin lähestymistapoihin. joista voidaan saada kvalitatiivista ja kvantitatiivista tietoa RNA-modifikaatioista, usein jopa sekvenssispesifisyyden tasolla. Koska RNA-tutkimus on vielä varhaisessa vaiheessa, se vaatii paljon tutkimustyötä. Uusien menetelmien, tekniikoiden ja ohjelmistojen kehittymisen myötä ymmärrys RNA-modifikaatioiden olemassaolosta, tarkoituksesta, toiminnasta ja vaikutuksesta elämään kasvaa. Työn kokeellisen osion aiheena oli derivatisoida lähettiribonukleiinihappo (mRNA) fluorisoivaksi ja kehittää analyyttinen erotusmenetelmä kapillaarielektroforeesilla (CE) laserindusoitua fluoresenssidetektoria (LIF) käyttäen. Fluoreskeiini-5-isotiosyanaatti (FITC) valittiin derivatisointireagenssiksi sen monipuolisen käytettävyyden vuoksi ja helpon saatavuuden takia. Edellisestä huolimatta on yleisesti tiedossa FITC:n nopea hajoaminen, mutta tähän asti ei ole raportoitu, kuinka nopeasti FITC todellisuudessa muuttuu reagointikyvyttömäksi. Menetelmän kehitysvaiheessa käytettiin RNA-tyyppisiä biologisia molekyylejä, kuten BSA ja aminohappoja. Työssä testattiin erilaisia puskureita eri pH-arvoilla ja pitoisuuksilla. Lisäksi optimoitiin injektiopaine ja -aika sekä virta käyttäen CE-laitteistoa varustettuna diodirividetektorilla (CE-UV). Koska työn päätavoitteena oli erotusmenetelmän kehittäminen, derivatisointireaktion toimivuuteen ei heti kiinnitetty tarpeeksi huomiota. Menetelmä optimoitiin leimatuille aminohapoille ja BSA:lle. Lopuksi siirryttiin viimeistelemään menetelmä CE-LIF:llä. Derivatisointituotteiden tunnistus tehtiin ESI-TOF-MS:lla. Siinä yhteydessä huomattiin FITC:n nopea hajoaminen. Monien haasteellisten kokeilujen jälkeen päädyttiin keskittyä FITC:n stabiiliuden selvittämiseen. FITC:ä myydään samalla cas-numerolla kahta eri konformeeria ja tämän lisäksi vielä eri cas-numerolla kahta isomeeria. Näillä kaikilla on hieman erilaiset fysikaaliset ominaisuudet, jotka selvitettiin tässä työssä. Tutkittiin FITC:n eri konformeerien stabiilisuutta erilaisissa liuottimissa ja kahdessa lämpötilassa kymmenen päivän ajan käyttäen ESI-TOF-MS-laitetta sekä positiivisella että negatiivisella polariteetilla. Tutkimuksessa standardoidulla derivatisointiproseduurilla testattiin FITC-kemikaalin avulla LIF-detektorin toimintaa. Kuitenkin mRNA-derivatisointiin vaaditaan kalliit leimauskitit, joita ei tässä vaiheessa ollut mahdollista hankkia. Pysyminen alkuperäisessä suunnitelmassa ja optimoida CE-LIF -metodi fluoresoivalla FITC-reagenssilla lähetti-RNA:n leimaamiseen ei aikataulullisesti onnistunut. Siten projekti painottui tämän kokeellisen työn osalta derivatisoinnin optimointiin ja FITC-kemikaalien kinetiikkaan. Sen vuoksi projektissa tehtiin perusteellinen pohjatyö tuleville tutkimuksille. Kokeellisesti onnistuttiin leimaamaan nukleotidiemäksiä, jotka ovat lähetti-RNA:n perusosia. Selvitettiin FITC:n hajoamisnopeus ja liuottimet, joita FITC-tutkimuksissa on käytetty ja joita tulee käyttää, jotta reaktio onnistuu. Leimaus onnistui p-kinoidille. Saatujen tulosten perusteella on mahdollista laskea FITC:n optimaalinen määrä onnistuneen reaktion kannalta. Lisäksi osoitettiin, että leimausreaktio on herkkä, kun käytetään optimaalista puskuria ja optimipitoisuuksia. Jatkotutkimuksissa myös FITC-liuoksen valmistamiseen pitää kiinnittää paljon huomiota.