Browsing by Author "Ojala, Elina"

Uusien lääkkeiden sydäntoksisuus ilmenee yleensä sydämen sähköisen toiminnan häiriöinä (rytmihäiriöt) ja supistustoiminnan heikkenemisenä. Tällä hetkellä uusien lääkemolekyylien sydänturvallisuutta arvioidaan lähinnä tutkimalla yhdisteen vaikutusta hERG-ionikanavan aktiivisuuteen sekä tutkimalla molekyylin vaikutusta aktiopotentiaalin kestoon. Nykymenetelmät perustuvat yksittäisiin solumalleissa tehtäviin ionikanavatutkimuksiin ja patch clamp-mittauksiin sekä koe-eläimillä tehtäviin toksisuustutkimuksiin. Nykymenetelmät ovat työläitä ja saadut tulokset eivät aina ennusta luotettavasti lääkeaineen sydänturvallisuutta ihmisen elimistössä. Optogenetiikka on optiikkaan ja geenimuokkaukseen perustuva menetelmä, joka mahdollistaa kohdesolujen tutkimisen ja hallitsemisen valon avulla. Menetelmässä hyödynnetään valoherkkiä proteiineja, opsiineja. Kun opsiineja koodaavat geenit on siirretty kohdesoluihin, voidaan solujen toimintaa arvioida ja ohjata valolla eri aallonpituuksia hyödyntäen. Optogeneettinen menetelmä soveltuu hyvin myös sydänlihassolujen sähköisen toiminnan tutkimiseen ja sydänlihassolujen tahdistamiseen. Sydänlihassolujen sähköfysiologisilla mittauksilla voidaan havaita esimerkiksi lääkeaineiden rytmihäiriövaikutuksia. Sydänlihassolujen tahdistamismahdollisuus kokeiden aikana on tärkeää, koska osa lääkkeen rytmihäiriövaikutuksista ilmaantuu vain normaalia korkeammilla syketaajuuksilla. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli pystyttää ja validoida uusi optogeneettinen menetelmä lääkkeiden sydäntoksisuuden arvioimiseen. Valoherkät opsiinit Optopatch ja CaViar vietiin lentivirustransduktiolla ihmisen kantasoluperäisiin (induced pluripotent stem cell, iPSC) sydänlihassoluihin. Transdusoituja sydänlihassoluja tahdistettiin sinisen laservalon avulla. Sydänlihassolujen sähköistä toimintaa arvioitiin mittaamalla aktiopotentiaaleja sekä solunsisäistä kalsiumvirtausta optogeneettisen fluoresenssi- videomikroskopian avulla. Kuvantamisdatan käsittelyyn kehitettiin Matlab-pohjainen automaattinen analyysiohjelmisto. Videomikroskopiadatasta analysoitiin ohjelmiston avulla sähköfysiologisia muuttujia, kuten sydänlihassolujen syketaajuus, aktiopotentiaalien kesto (action potential duration, APD) ja amplitudi (APA) sekä kalsiumvirtauksen kesto (calcium transient duration, CTD). Optogeneettiseen menetelmään yhdistettiin myös videomikroskopia, jonka avulla voitiin arvioida solujen supistuvuutta. Optogeneettisellä menetelmällä saatuja tuloksia verrattiin patch clamp- menetelmällä saatuihin tuloksiin. Lentivirustransduktiot eivät olleet soluille toksisia, eikä virusten todettu aiheuttavan tilastollisesti merkitsevä muutoksia sydänlihassolujen sähköisessä toiminnassa. Optogeneettisella menetelmällä rekisteröidyt sähköfysiologiset muuttujat (syketaajuus, APD, APA) eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi patch clamp- mittauksilla saaduista tuloksista. Tutkimustulostemme perusteella voidaan optogeneettista menetelmää pitää yhtä luotettavana kuin perinteistä patch clamp-menetelmää. Lääkeainekokeissa sydänlihassolut altistettiin E-4031:lle (hERG kaliumkanavan salpaaja). Lääkkeen annosvasteiset tutkimukset tehtiin sekä spontaanisykkeellä että 1 Hz:n ja 2 Hz:n taajuuteen tahdistetuilla rytmeillä. E-4031 pidensi pienillä pitoisuuksilla aktiopotentiaalin kestoa, jota seurasivat suurilla pitoisuuksilla havaitut varhaiset jälkipolarisaatiot (early afterdepolarization, EAD) ja lopuksi sykkeen loppuminen. Patch clamp- ja supistuvuusmittauksissa saatiin esille samanlaiset vasteet E-4031 lääkealtistuksille. Samankaltainen, mutta E-4031:a vaatimattomampi lääkeainevaste saatiin esiin, kun solut altistettiin JNJ-303:lle (IKs kaliumkanavan salpaaja). Sydänlihassolujen optogeneettinen menetelmä soveltuu korvaamaan ja täydentämään perinteistä patch clamp-menetelmää uusien lääkkeiden sydäntoksisuustutkimuksissa. Yksittäisiin ionikanavatutkimuksiin soveltuu edelleen parhaiten patch clamp-menetelmä. Nopeutensa vuoksi optogeneettinen kuvantaminen soveltuu erityisesti lääkeaineaihioiden teho- ja turvallisuusseulontaan. Ei-invasiivisena menetelmänä optogenetiikka mahdollistaa myös pitkäaikaiset lääkeainealtistuskokeet.