Browsing by Subject "Saccharomyces cerevisiae"

Orgaanisilla hapoilla on useita käyttötarkoituksia muun muassa lääke-, elintarvike- ja polymeeriteollisuudessa. Tässä työssä perehdyttiin L-arabonaatin biotekniseen tuottamiseen L- arabinoosista, jota esiintyy runsaasti biomassan hemiselluloosassa toisen pentoosisokerin, D- ksyloosin, ohella. Neljä potentiaalista dehydrogenaasientsyymiä, jotka tuottavat L-arabinoosista L-arabonaattia katalysoimalla hapetusreaktiota, identifioitiin kirjallisuuden ja bioinformatiikan avulla. L-arabonaatin tuottoa testattiin ilmentämällä näitä geenejä Saccharomyces cerevisiae -hiivassa, jota kasvatettiin L-arabinoosia sisältävällä kasvatusalustalla. Näistä entsyymeistä tehokkain, joka oli peräisin juurinystyrästä eristetystä Rhitzobium leguminosarum bv. trifolii -bakteerista, puhdistettiin ja karakterisoitiin. Entsyymi nimettiin L-arabinoosi/D-galaktoosi 1dehydrogenaasiksi (EC 1.1.1.-), Rl AraDH. Rl AraDH kuuluu Gfo/Idh/MocA -proteiiniperheeseen ja suosii kofaktorina NADP+:a verrattuna NAD+:iin. Rl AraDH entsyymillä on suurin katalyyttinen aktiivisuus (kcat/Km) käytettäessä substraattina L-arabinoosia, D-galaktoosia ja D-fukoosia. Rl AraDH:n rakennetutkimukset, jotka suoritettiin käyttäen ydinmagneettista resonanssia (NMR) ja proteiinimallinnusta, osoittivat entsyymin suosivan substraattina L-arabinoosin α-pyranoosimuotoa. Entsyymin hapetusreaktion stabiili tuote havaittiin olevan L-arabino-1,4-laktoni, joka voi myös aueta hitaasti neutraalissa pH:ssa lineaariseksi L-arabonaatiksi. Entsyymin pH optimi on 9, mutta hiivan kasvatukseen sopivan puskurin käyttö pH:ssa 6.8 osoitti, että hyvää katalyyttista aktiivisuutta voitiin odottaa myös in vivo -olosuhteissa. Rl AraDH:n ilmentäminen S. cerevisiae -hiivassa yhdessä L-arabinoosin sisäänottoa soluun lisäävän galaktoosipermeaasin (Gal2) kanssa johti 18 g/l L-arabonaatin tuottoon nopeudella 248 mg/l/h, saantoprosentin ollessa 86 %. Näin ollen uuden työssä karakterisoidun Rl AraDH:n osoitettiin olevan käyttökelpoinen ja tehokas entsyymi tuotettaessa L-arabonaattia S. cerevisiae -hiivassa. L- arabonaatin tuottaminen L-arabinoosista on osa biojalostamoiden kehittämisprosessia, jonka tavoitteena lignoselluloosaa sisältävästä biomassasta on tuottaa uusia käyttökelpoisia yhdisteitä.