Browsing by Author "Sarajärvi, Saara"

Lactobacillus rhamnosus GG on yksi eniten tutkituista ja käytetyistä probioottisista maitohappo-bakteereista. Sillä on erinomainen adheesiokyky, mikä on ensisijaisesti sen SpaCBA-piluksen ansiota. Piluksen lisäksi sen pinnalta on löydetty kaksi muuta adhesiivista proteiinia: MabA (modulator of adhesion and biofilm) ja MBF (mucus binding factor). Adhesiivisuuden lisäksi MBF-proteiinin uskotaan vaikuttavan L. rhamnosus GG:n kykyyn muodostaa biofilmejä, joilla voi olla suolistoa suojaavia vaikutuksia. Tämän tutkielman tavoitteena oli kloonata L. rhamnosus GG:n MBF-proteiinia koodaava geeni L. lactis NZ9100 -kantaan ja tutkia sen vaikutusta adheesioon ja biofilmin muodostukseen. Kohdegeenin monistamiseksi L. rhamnosus GG:stä eristetystä genomisesta DNA:sta käytettiin PCR-menetelmää. Geeni liitettiin osaksi kolmea eri kloonausvektoria: pNZ8121, pNZ8122 ja pNZ8124 ja transformaatio suoritettiin elektroporaatiolla. Geenin ilmentymistä L. lactis -soluissa tutkittiin irrottamalla ja denaturoimalla solujen pintaproteiinit ja erottelemalla ne SDS-PAGE-menetelmällä. MBF-proteiinin vaikutusta adheesioon ja biofilmin muodostukseen tutkittiin 96 kaivon kuoppalevyillä. Biofilmin muodostumiskykyä selvitettiin käyttämällä hydrofiilisiä polystyreenipohjaisia kuoppalevyjä. Adheesion tutkimiseksi kuoppalevyjen kaivot oli päällystetty porsaan musiinilla. Kohdegeenin kloonaaminen L. lactis NZ9100 -kantaan onnistui plasmidilla pNZ8124, jossa oli Usp45-proteiinin signaalisekvenssi proteiinin erittämistä varten. Pintaproteiinien tutkimiseen käytetyn SDS-PAGE-menetelmän perusteella näyttäisi siltä, että kohdegeenin sisältäneet L. lactis -solut tuottivat ja erittivät MBF-proteiinia, joka todennäköisesti oli kiinnittynyt LPNTN-motiivillaan isäntäbakteerin soluseinään. MBF-proteiinin määrä solujen pinnalla oli kuitenkin erittäin pieni. Tässä tutkimuksessa MBF-proteiinia tuottavat L. lactis -solut eivät tarttuneet porsaan musiiniin eivätkä alkaneet muodostaa biofilmiä kuoppalevyillä kasvatettaessa. Koska MBF-proteiinin on osoitettu olevan adhesiivinen proteiini, johtui negatiivinen tulos adheesion osalta todennäköisesti siitä, että MBF-proteiinia tuotettiin liian vähän, jotta se olisi tehnyt solut adhesiivisiksi. Biofilmin muodostumisen osalta negatiivinen tulos johtuu myös todennäköisesti MBF-proteiinin pienestä määrästä solujen pinnalla. On myös mahdollista, ettei MBF-proteiini yksin riitä biofilmin muodostukseen, vaan bakteerisolujen on tuotettava muitakin biofilmin muodostukseen osallistuvia pintakomponentteja.