Browsing by Author "Hietala, Ville"

Antibioottiresistenssi yleistyy infektioita aiheuttavien bakteereiden keskuudessa. Infektioita hoitaessa joudutaan siten miettimään uusia tapoja infektioiden parantamiseksi. Yhden vaihtoehdon tarjoaa bakteriofagiterapia. Siinä infektiota sairastavalle annetaan bakteriofageja, jotka infektoivat bakteereita, lisääntyvät niissä ja tuhoavat ne. Kirjallisuudessa on runsaasti lupaavia esimerkkejä tästä terapiamuodosta. Kuitenkin bakteriofagituotteiden on oltava tarpeeksi puhtaita, erityisesti siinä tilanteessa, jos niitä annetaan suonensisäisesti. Gramnegatiivisten bakteereiden tärkeä rakenneosa on lipopolysakkaridi eli LPS, joka ihmisen verenkiertoon päästessään voi olla vaarallinen. Siksi, mikäli bakteriofagit on tuotettu gramnegatiivisissa bakteereissa, LPS:t on kyettävä poistamaan näytteistä. Tässä Pro Gradu-työssä tutkittiin viidessä eri koejärjestelyssä, kuinka erilaiset tekniikat ja niiden yhdistelmät vaikuttivat bakteriofagien ja LPS:n määrään näytteissä. Lisäksi arvioitiin SDS-PAGE-geelissä näytteiden proteiinikoostumusta. Näytteistä mitattiin myös dsDNA-pitoisuus. Tutkitut tekniikat olivat ultrafiltraatio, anioninvaihtokromatografia, oktanoliuutto ja kaupalliset endotoksiininpoistotuotteet EndoTrap- ja Pierce high endotoxin removal-pylväät. Koejärjestelyssä 1 suodatettua bakteriofagilysaattia puhdistettiin ensiksi oktanoliuutolla, sitten ultrafiltraatiolla, anioninvaihtokromatografialla ja lopuksi uudella ultrafiltraatiolla. Endotoksiinipitoisuus laski eniten kromatografiassa mutta toisen ultrafiltraation jälkeen se pysyi varsin samana. Tiitteri pieneni vain oktanoliuutossa ja kromatografiassa (jossa osittain laimenemisen takia), kun ultrafiltraatioissa muutos edeltävään tiitteriin oli varsin pieni. Lopuksi näytteissä oli keskimäärin n. 15 EU (endotoksiiniyksikköä)/10^9 pfu (plaque forming unit). Toisessa koejärjestelyssä aloitettiin ultrafiltraatiolla ja sen jälkeen näytteet puhdistettiin joko EndoTrap- tai Pierce-pylväällä. Kaikki vaiheet poistivat endotoksiineita. Ultrafiltraatio pienensi hieman tiittereitä mutta EndoTrap-pylväs ei. Pierce-pylväässä tiitterin aleneminen oli huomattavaa, jolloin EndoTrap-pylvään jälkeen näytteissä oli keskimäärin 0,0574 EU/10^9 pfu ja Pierce-pylvään jälkeen 33700 EU/10^9 pfu eli suhde oli jopa enemmän kuin lysaatissa. Kolmannessa koejärjestelyssä aloitettiin ultrafiltraatiolla, jonka jälkeen oli kromatografia ja uusi ultrafiltraatio. Ensimmäisessä ultrafiltraatiossa tiitterit pienenivät jonkin verran mutta kromatografian ja toisen ultrafiltraation jälkeen se oli varsin sama, kuin ensimmäisen ultrafiltraation jälkeen. Endotoksiinipitoisuus pieneni taas eniten kromatografiassa ja se oli varsin sama toisen ultrafiltraation jälkeen, jolloin puhdistetuissa näytteissä oli keskimäärin 57,1 EU/10^9 pfu. Neljännessä koejärjestelyssä lysaattia ultrafiltroitiin ensiksi, sen jälkeen ruiskutettiin kromatografialaitteeseen, ultrafiltroitiin uudestaan ja sen jälkeen puhdistettiin joko EndoTrap- tai Pierce-pylväällä. 1. ultrafiltraatio pienensi taas hieman tiitteriä mutta se oli varsin sama EndoTrap-pylväällä puhdistetussa näytteessä. Pierce-pylvään kanssa tiitteri pieneni taas huomattavasti. Endotoksiinipitoisuudet pienenivät taas kaikissa vaiheissa, jolloin EndoTrap-pylväällä puhdistetussa näytteissä oli keskimäärin 0,0839 EU/10^9 pfu ja Pierce-pylväällä 5480 EU/10^9 pfu. Viides koejärjestely oli muuten sama, kuin koejärjestelyn 2 Pierce-pylväs järjestely mutta korkeamman NaCl-pitoisuuden eluutiopuskurilla ja suuremmalla näytetilavuudella. Tällöin tiitteri ei pienentynyt yhtä paljon, endotoksiinipitoisuus oli lopussa vain hieman korkeampi kuin koejärjestelyssä 2 ja loppuun asti puhdistetussa näytteessä oli keskimäärin 71,21 EU/10^9 pfu. SDS-PAGE-tutkimuksessa ja dsDNA-mittauksissa näkyi, että ultrafiltraatio yksin riittää poistamaan muut bakteeriperäiset proteiinit ja dsDNA:n. Tosin koejärjestelyssä 1 käytetty oktanoli saattaa vaikuttaa dsDNA:n puhdistumiseen ultrafiltraatiossa. Töissä onnistuttiin tuottamaan näytteitä, joissa sekä riitti bakteriofageja, että endotoksiinipitoisuus oli pudonnut huomattavasti. Kun huomioidaan käytännöllisyys ja nopeus, parhaaksi tavaksi puhdistaa LPS:t valikoitui ultrafiltraatio yhdistettynä EndoTrap-pylvääseen. Johtuen bakteriofagien ja LPS:ien monimuotoisuudesta, ei toisella bakteriofagilla välttämättä päästä samoihin