Browsing by Author "Partti, Edvard"

Kaurapohjaiset elintarvikkeet ovat terveellisiä. Monet niiden terveyshyödyt johtuvat kauran liukoisen ravintokuidun suuresta β-glukaanipitoisuudesta. β-glukaanin terveysvaikutukset ovat riippuvaisia sen molekyylipainosta ja viskositeetista. Viskositeetilla on myös muuta merkitystä kaurapohjaisissa elintarvikkeissa kuten kaurajugurteissa ja kauramaidoissa. Aiemmassa Folafibre-tutkimusprojektissa oli tutkittu kaurakuidun folaattipitoisuuden (B9 vitamiini) kasvattamista fermentoimalla sitä eri mikrobeilla. Hyvin folaattia tuottaneet mikrobit myös alensivat kaurakuituvalmisteen viskositeettia, ja erittivät glykosyylihydrolaaseja ja/tai proteaasia. Oli kuitenkin jäänyt epäselväksi, olivatko entsyymit ainut syy viskositeetin alenemiseen, ja kuinka paljon kullakin niistä oli vaikutusta viskositeettiin. Lisäksi tämän alan kirjallisuudessa on pidetty epäselvänä, onko esim. tärkkelyksen ja β-glukaanin välillä jotain interaktioita jotka mm. nostavat niiden viskositeettia yli yksittäisten polymeerien viskositeetin summan. Näitä voitaisiin selvittää puhdistamalla viskositeettia alentaneista mikrobikannoista kyseiset entsyymit ja tutkimalla niiden vaikutusta kaurakuidun viskositeettiin. Yhdeksi mikrobiksi valittiin Exiguobacterium sp. RB3 kanta, koska em. syiden lisäksi tässä bakteerisuvussa esiintyy psykrofiilejä ja mikrobeja jotka voivat kasvaa korkeassa pH:ssa, jolloin sen erittämät entsyymit saattaisivat olla aktiivisia matalissa lämpötiloissa ja korkeassa pH:ssa, ja olla siten teollisesti kiinnostavia. Toiseksi mikrobiksi valittiin Bacillus sp. ABM5119, koska sitä oli käytetty monissa Folafibre-projektin tutkimuksissa. Työn tavoitteena oli puhdistaa Bacillus sp. ABM5119:n endo-β-1,4-glukanaasi, ja Exiguobacterium sp. RB3:n α-amylaasi ainakin siinä määrin, että ne ovat muista endoaktiivisista glykosyylihydrolaaseista ja proteaaseista puhtaita, ja sitten mitata puhdistettuja entsyymejä ja proteaasia käyttäen niiden vaikutus yhdessä ja erikseen keitetyn kaurakuituvalmisteen viskositeettiin. Lisäksi tavoitteena oli karakterisoida Exiguobacterium sp. RB3 amylaasin olennaisimmat biokemialliset ominaisuudet, sekvensoida sen geenin amylaasia koodaava alue, ja selittää sen ominaisuuksia myös sekvenssistä johdettavissa olevan tiedon perusteella. Keitetyn kaurakuitupreparaatin viskositeettia alentavat eniten α-amylaasi ja endo-β-1,4-glukanaasi. Proteaasi ei vaikuta kaurakuitupreparaatin viskositeettiin, kun kuitupreparaatti on keitetty. Endo-β-1,4-glukanaasi alentaa viskositeettia yhtä hyvin kuin β-1,3-1,4-glukanaasi. Synergiaa viskositeetin alentamisessa α-amylaasilla ja endo-β-1,4-glukanaasilla ei havaittu, mutta havaittiin että β-glukaani saattaa estää tärkkelyksen retrogradaatiota. Hyvin pienetkin entsyymiaktiivisuudet vaikuttavat viskositeettiin. Jos halutaan β-glukaanin viskositeetin ja siten terveysvaikutusten säilyvän, täytyy esim. kauramaidon valmistuksessa käytettävien entsyymivalmisteiden olla β-glukanaaseista hyvin puhtaita. Mikrobifermentaatioissa tapahtuvat viskositeetin alenemat johtuvat lähinnä mikrobien erittämistä glykosyylihydrolaaseista, ei niinkään esim. niiden metabolian sivutuotteista kuten happiradikaaleista. Exiguobacterium sp. RB3 α-amylaasi on rakenteeltaan Bacillus licheniformis α-amylaasin kaltainen glykosyylihydrolaasiryhmän 13 entsyymi. Se sitoo rakenteeseensa kolme kalsiumiatomia, ja kalsiumpitoisuus vaikuttaa sen aktiivisuuteen. Se on aktiivisimmillan pH alueella 5,0 – 7,5. Se sietää detergenttejä, toisin kuin eräs aiemmin karakterisoitu Exiguobacterium-α-amylaasi. RB3 α-amylaasin turnover number oli korkea, 29000 1/s. Exiguobacterium-suvun psykrofiilisessä haarassa esiintyy kahta eri α-amylaasia, joista yksi on tässä karakterisoitu, ja toinen on selvästi erilainen rakenteeltaan ja biokemiallisilta ominaisuuksiltaan.