Browsing by Title

Kampylobakteerit ovat gramnegatiivisia, pääosin mikroaerobisia bakteereja, joita esiintyy monien eläinten suolistossa. Ihmisille kampylobakteerit ovat erityisesti suoliston taudinaiheuttajia ja kampylobakteerit ovatkin yleisimpiä bakteeriperäisiä ihmisten suolistotulehduksen aiheuttajia kehittyneissä maissa, myös Suomessa. Suolistotulehduksen lisäksi kampylobakteerit voivat aiheuttaa ihmisille esimerkiksi Guillain-Barré -hermostosairautta ja pitkäkestoisiakin niveloireita aiheuttavaa reaktiivista niveltulehdusta. Ihmisen tyypillisimmät taudinaiheuttajat kampylobakteereista ovat Campylobacter jejuni ja Campylobacter coli. Näistä kahdesta selvästi yleisempi taudinaiheuttaja on C. jejuni. Sekä C. jejuni että C. coli ovat termofiilisiä kampylobakteereja. Kampylobakteeritartunta on yleensä ulosteperäinen ja erityisesti ulosteella saastunut broilerinliha on tärkeä kampylobakterioosin lähde. Maatilojen ympäristössä olevien jyrsijöiden on todettu olevan yksi kampylobakterioosin riskitekijöistä ja kampylobakteereja on havaittu jyrsijälajeilla, esimerkiksi metsähiirillä ja vesimyyrillä. Suomessa jyrsijöiden kantamia kampylobakteereja ei ollut tutkittu ennen tämän tutkielman aloittamista. Päästäisiä koskevia tutkimuksia kampylobakteerien osalta on maailmanlaajuisestikin hyvin vähän. Tutkimusosiossa tutkittiin termofiilisten kampylobakteerien yleisyyttä suomalaisissa pienjyrsijöissä ja päästäisissä. Tutkimuksen hypoteesina oli, että suomalaisista piennisäkkäistä löytyy kampylobakteereja. Tutkimuksessa tutkittiin yhteensä 372 eläintä 12:sta eri lajista, jotka oli pyydystetty 24:ltä paikalta eri puolilta Suomea. Tutkituista eläimistä 342 oli jyrsijöitä ja 40 päästäisiä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää isäntälajien välisiä eroja kampylobakteerien yleisyyden suhteen sekä esimerkiksi kampylobakteerien yleisyyttä eri puolilla Suomea. 76 metsämyyrää oli pyydetty keväällä ja kesällä vuonna 2017, kun taas vuodelta 2015 oli 82 metsämyyrää. Näitä kahta vuotta verrattiin toisiinsa mahdollisten vuosittaisten kampylobakteerierojen havaitsemiseksi metsämyyrissä. Tutkimus suoritettiin viljelemällä eläinten ulostetta selektiivisille kasvatusmaljoille, joita inkuboitiin termofiilisille kampylobakteereille otollisissa olosuhteissa. Bakteerikasvustoa viljeltiin tämän jälkeen epäselektiivisille maljoille puhdasviljelmiksi, joista tehtiin DNA-eristys. DNA:ta monistettiin PCR-menetelmän avulla ja PCR-tuotteet tutkittiin geelielektroforeesin avulla bakteerilajien tunnistamiseksi. Tulokset olivat hypoteesin mukaiset. Tutkimuksessa todettiin C. jejunia 17,7 %:lla tutkituista eläimistä. Kampylobakteereja havaittiin neljällä jyrsijälajilla: metsähiirillä, punamyyrillä, metsämyyrillä ja peltomyyrillä. Suurinta esiintyvyys oli punamyyrillä, joista 63,6 % oli kampylobakteeripositiivisia. Kaikki tutkitut päästäisnäytteet olivat kampylobakteerinegatiivisia. Metsämyyrillä ja metsähiirillä todettiin paikkakunnan vaikuttavan kampylobakteerien yleisyyteen. Metsämyyrillä oli kampylobakteereja merkittävästi enemmän vuonna 2017 kuin 2015, mikä voi liittyä metsämyyrien vuosittaisiin kannanvaihteluihin. Tutkimustulosten perusteella jyrsijät voivat mahdollisesti toimia kampylobakteerien reservuaarina ja mahdollisesti myös ihmisten kampylobakterioosin lähteenä. Jyrsijät voivat mahdollisesti esimerkiksi tartuttaa ihmisiä tai maatilan eläimiä tai saastuttaa toimintatiloja tai vesilähteitä. Jatkotutkimuksia kuitenkin tarvitaan esimerkiksi selvittämään sitä, ovatko suomalaisten jyrsijöiden kantamat kampylobakteerit ihmiselle patogeenisiä kantoja. Campylobacters are gram negative, mostly microaerobic bacteria that live in the intestines of many animal species. Campylobacters are the most common cause of human bacterial enteritis in developed countries, including Finland. The most common human pathogens of Campylobacter spp. are Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Campylobacter infection happens usually via fecal contamination. Especially contaminated, undercooked broiler meat is an important source of campylobacteriosis. Rodents near farms are noted as a risk factor for campylobacteriosis, and Campylobacter spp. have been detected in some rodent species. Studies regarding campylobacters in shrews are minimal worldwide. In this thesis, the Campylobacter occurrence in Finnish small rodents and shrews was studied. The hypothesis was that Finnish small mammals do carry Campylobacter spp. 342 rodents and 40 shrews from 12 species trapped from 24 locations throughout Finland were studied. The purpose of the study was to detect differences in Campylobacter occurrence between host species and for example to compare the occurrence in different parts of Finland. Possible annual differences in bank voles were studied with 76 animals from 2017 and 82 animals from 2015. The study was performed by cultivating fecal samples to selective agars that were incubated in conditions suitable for thermophilic Campylobacter spp. Bacterial growth was cultivated to non-selective agars for pure growth and DNA isolation was performed. DNA was multiplied using PCR and gel electrophoresis was used to determine the Campylobacter species. The results were consistent with the hypothesis. Four rodent species were Campylobacter positive: yellow-necked mouse, northern red-backed vole, bank vole and field vole. The occurrence was highest in northern red-backed voles, where 63,6 % of the animals were Campylobacter positive. Al thel studied shrews were Campylobacter negative. Bank voles had campylobacters significantly more in 2017 than in 2015, which may relate to the annual population chances in bank voles. According to the results it is possible that rodents could act as Campylobacter reservoir and source of human campylobacteriosis. Rodents could possibly infect humans or farm animals or contaminate estates or water sources. Further studies are needed to determine for example if the campylobacters in Finnish rodents’ strains are pathogenic for humans.

Capnocytophaga cynodegmi löytyi 9:stä eläimestä (26%) ja C.canimorsus 5:sta (14%) 35 kissan otoksestamme. Rapid-paneelit olivat nopeat ja helppokäyttöiset. Testisarjojen antamat tulokset on esitetty taulukoissa 2A - 4B. C. cynodegmikantojen "mikrokoodeja" ei löytynyt valmistajan käsikirjasta. C. canimorsus antoi satunnaisesti saman mikrokoodin kuin Gardenella vaginalis, mutta bakteerit ovat helposti erotettavissa toisistaan, koska G. vaginalis on aina katalaasinegatiivinen. Sakkaroositestinsä ansiosta Rapid NH kykeni erottamaan C. cynodegmin ja C. canimorsuksen toisistaan, mihin Rapid NF+ ei kunnolla pystynyt. Rapid NF+ erotti kuitenkin eläinperäiset Capnocytophagat muista testitietokantaan kuuluvista bakteereista. Mikäli valmistaja lisäisi kyseiset mikrokoodit luetteloihinsa, eläinperäisten Capnocytophagojen identifioiminen olisi nykyistä huomattavasti nopeampaa (4 h verrattuna 5-7 päivään). Bakteeri pystyttäisiin löytämään useammin kuin ennen, sillä usein verilevyt hävitetään 3 vrk:n inkubaation jälkeen, vaikka Capnocytophagat kasvavat silmin näkyviksi pesäkkeiksi CO2-atmosfäärissäkin vasta n. 5 vrk:ssa. Harvinaisia bakteereita ei laboratorioissa monesti osata lainkaan epäillä. Mikäli DF-2-bakteerien nimi tulisi "automaattisesti" kaupallisen testisarjan tiedostosta, niiden tunnistus osuisi oikeaan nykyistä selvästi useammin.

Clostridium botulinum is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming bacterium that is found widely in nature. C. botulinum produces highly potent neurotoxin which causes paralysis. Yet, it is not known why the toxin is produced. C. botulinum poses a risk for the food industry, when spores germinate in food and start producing toxin. The aim of this study was to report how different carbohydrates and metabolites affect growth, toxin production and sporulation of C. botulinum. The hypothesis was that different substrates have different influence on the metabolism of C. botulinum. Earlier studies show which carbohydrates are utilized by C. botulinum but only few relate nutrient availability to toxin production. Glucose is the far most studied carbohydrate and it is known to support growth and toxin production. Growth in defined medium with added substrates was measured with Bioscreen. The method is based on measuring optical density of the cultures; optical density increases when the bacteria divide. Toxin levels were measured from 1 d and 5 d samples with a commercial ELISA (ELISA, enzyme-linked-immunosorbent-assay). The number of spores produced was measured after five days of growth. Vegetative cells were destroyed by heating (10 min, 80 °C) and MPN-method was conducted (MPN, most-probable number). With added glucose and glucose derivates (trehalose, maltotriose), growth and toxin production were induced most compared to control medium. High spore numbers were also measured. Higher concentrations of these substrates supported growth more than the lower concentrations. With higher concentrations of glucose and maltotriose the toxin levels were lower compared to low concentrations. With trehalose toxin levels were similar at high and low concentration. It can be concluded that the maximal growth density alone does not determine the toxin levels. N-acetylglucosamine (GlcNAc), which is found in bacterial cell walls, supported growth similar to glucose. GlcNAc supported also high sporulation and toxin production. Even though GlcNAc is a major component of chitin (e.g. the insect exoskeleton), chitin did not support toxin production or sporulation as efficiently as GlcNAc. The results indicate that C. botulinum might favor environments with fungi, dead bacteria or degraded chitin. By utilizing compounds from dead bacteria or insects, C. botulinum might have a role in circulating nutrients in anaerobic environment.

Medetomidiini on α2-adrenoseptoriagonisti ja sen käyttö sedatiivina on kliinisessä eläinlääketieteessä hyvin yleistä. Medetomidiinilla saadaan aikaan sedaatio, joka annoksesta ja antoreitistä riippuen vaihtelee kevyestä uneliaisuudesta syvään sedaatioon, joka mahdollista pienet noninvasiiviset toimenpiteet. Medetomidiiniä käytetään usein yhdessä muiden lääkeaineiden kanssa, sillä esimerkiksi medetomidiini ja butorfanoli potentoivat toistensa vaikutuksia. Esilääkityksenä annettu medetomidiini vähentää myös yleisanesteettien tarvetta. α2-adrenoseptoriagonistien sedatiivinen vaikutus johtuu keskushermostossa tapahtuvaan presynaptisten α2-adrenoseptoreiden aktivaatiosta, mikä vähentää noradrenaliinin erittymistä synapsirakoon ja heikentää siten hermoimpulssien kulkua. α2-adrenoseptoreita on myös keskushermoston ulkopuolella esimerkiksi verisuonten sileän lihaksen pinnalla. Näiden perifeeristen α2-adrenoseptoreiden aktivaatio lisää verisuonten supistumista. Medetomidiini aiheuttaa haittavaikutuksina sykkeen ja sydämen minuuttitilavuuden laskua, verisuonten vastuksen nousua, muutoksia verenpaineeseen sekä erityisesti märehtijöillä hapen osapaineen laskua valtimoveressä. Verenpaineen muutos on kaksivaiheinen, sillä verenkierron vastuksen nousu perifeerisestä α2-adrenoseptoriaktivaatiosta johtuen nostaa verenpaineen ensin korkeaksi. Myöhemmin verenpaine laskee johtuen medetomidiinin sympatolyyttisistä keskushermostovaikutuksista. Verenkierron vastuksen noususta johtuva verenpaineen nousu käynnistää barorefleksin, jonka seurauksena syke laskee entisestään. Medetomidiinin aiheuttama sedaatio voidaan kumota ja haittavaikutuksia lievittää α2-adrenoseptoriantagonisti atipametsolilla. Vatinoksaani on toistaiseksi vain tutkimuskäytössä oleva α2-adrenoseptoriantagonisti, joka voidaan annostella yhdessä medetomidiinin kanssa samassa ruiskussa suonen- tai lihaksensisäisesti. Se ei juuri ylitä veriaivoestettä, eikä siten vaikuta medetomidiinin keskushermostovaikutuksiin, kuten sedaatioon. Se lievittää medetomidiinin aiheuttamia perifeerisestä α2-aktivaatiosta johtuvaa verenkierron vastuksen nousua ja vähentää siten verenpaineen nousua. Tämä vähentää barorefleksin aktivoitumista ja estää sykkeen ja sydämen minuuttitilavuuden laskua. Tämän tutkimuksen tavoitteena on selvittää vatinoksaanin, atipametsolin ja medetomidiinin yhteisvaikutuksia, kun vatinoksaani annostellaan lihaksen sisäisesti yhdessä medetomidiinin kanssa. Hypoteesi on, että vatinoksaani lievittää medetomidiinin haittavaikutuksia ilman, että se heikentää rauhoitusta tai heräämistä. Tutkimukseen käytettiin kahdeksaa lammasta, joista kukin sedatoitiin sekä pelkällä medetomidiiniä (30 μg/kg) tai medetomidiini-vatinoksaaniseoksella (30 μg/kg ja 300 μg/kg vastaavasti). 30 minuutin kuluttua annosteltiin atipametsoli (150 μg/kg).120 minuutin seurantajakson aikana kardiopulmonaarisia muuttujia mitattiin tietyin aikavälein. Sedaation tasoa seurattiin subjektiivisesti asteikolla 0-10. Vatinoksaani lievitti merkittävästi medetomidiinin aiheuttamia muutoksia sykkeeseen atipametsoli-injektion jälkeen ja verenkierron vastukseen jo ennen sitä. Vatinoksaani joudutti verenpaineen nousua ja hapen osapaineen laskua 10 minuuttia medetomidiinin annostelun jälkeen. Sekä sedatoituminen että herääminen oli varmempaa ja nopeampaa vatinoksaanin läsnä ollessa. Tuloksista voi päätellä, että vatinoksaanin käyttö saattaa parantaa sedaation kardiopulmonaarista laatua ja sen käyttö lampailla on turvallista myös siinä tapauksessa, että sedaatio kumotaan atipametsolilla.

Clostridium botulinum is an anaerobic, endospore-forming bacterium able to produce botulinum neurotoxin which causes life-threatening botulism to human and animals. The classical food botulism follows when food containing preformed neurotoxin is ingested. C. botulinum strains form four phenotypically distinct groups of organisms (I-V). The strains causing human botulism belong to groups I and II. They are a risk to the food industry since the spores of group I are higly resistant to heat and the strains of group II can grow at refrigeration temperatures. A profound understanding of the mechanisms behind cold and heat resistance of C. botulinum will minimize the risks posed by this pathogen in the food industry. Two-component systems utilizing a phospotransfer mechanism between a sensor kinase and a response regulator are known to be the mostly used mechanisms in adaptation to different environmental conditions. However, their role in the physiology and stress tolerance of C. botulinum is unclear. The purpose of this study was to find out the role of a CBO0366 gene, encoding a sensor kinase belonging to a two-component system, in the physiology and cold and heat resistance of C. botulinum. The novel ClosTron-system was used in this study to inactivate the CBO0366 gene of the ATCC 3502 strain of C. botulinum. The system is based on re-targeting the mobile group II intron of the pMTL007-plasmid by using Splicing by Overlap Extension PCR (SOE-PCR), resulting in the intron inserting into the CBO0366 gene of C. botulinum. The insertion of the intron interrupts the reading frame of the gene. The physiology and cold and heat resistance of the mutant strain were researched by using the wild type of ATCC 3502 as a control. The growth on blood and egg yolk agar, metabolic activity, and growth curves at 37 and 45 °C, of the mutant strain were identical to the wild type. By contrast, at 15 ° and 20 °C the mutant strain grew slower. The results indicate that the CBO0366 gene has a central role in the cold resistance of C. botulinum ATCC 3502. It thus can be expected that the sensor kinase encoded by CBO0366 is a part of a two-component system responsible for responses needed in adaptation to cold. Inactivation of the gene probably inhibits the cold signal and subsequently the specific response inside the cell. Thus adaptation to cold is slower. The mutant strain nevertheless grew at 15 °C so the gene is probably not essential in survival in lower temperatures.

Tämän lisensiaatintutkielman kirjallisuuskatsauksen tavoitteena on koota yhteen tämänhetkinen tutkimustieto Chiari-tyyppisen epämuodostuman, kallo-kaularankaliitoksen ahtauman ja syringomyelian yleisyydestä, etiologiasta, patogeneesistä, diagnostiikasta, oireista ja niihin liitetyistä kuvantamislöydöksistä, hoidosta ja ennusteesta, sillä tasolla, jolla kliinistä työtä tekevän praktikon olisi hyvä tuntea aihetta. Aihe on oleellinen uuden, etenkin oireita koskevan tutkimustiedon takia. Pienten brakykefaalisten koirarotujen suosion lisääntymisen myötä Chiari-tyyppisen epämuodostuman, kallo-kaularankaliitoksen ahtauman ja syringomyelian yleisyys koirapopulaatiossa saattaa lisääntyä, mikä lisää tarvetta tunnistaa näiden rakenteellisten poikkeamien aiheuttamat oireet. Chiari-tyyppiselle epämuodostumalle, kallo-kaularankaliitoksen ahtaumalle ja syringomyelialle alttiita ovat brakykefaaliset pienet rodut. Se on erityisen yleistä cavalier kingcharlesinspanielilla ja chihuahualla. Chiari-tyyppinen epämuodostuma on kallo-kaularankaliitoksen ja useiden kallon luiden kehityshäiriö, jossa kallon koko on suhteessa liian pieni aivojen kokoon nähden. Tämän seurauksena aivot järjestäytyvät kallon sisällä uudelleen ja pikkuaivot tyräytyvät niska-aukkoon. Chairi-tyyppisen epämuodostuman taustalla uskotaan olevan takaraivon rustoliitoksen liian aikainen luutuminen. Kallo-kaularankaliitoksen ahtaumassa kallon ja kaularangan luiset rakenteet ovat normaalia lähempänä toisiaan, ja alueen hermokudokselle jää normaalia vähemmän tilaa. Syringomyelia on selkäytimen nesteontelotauti, jota todetaan usein Chiari-tyyppisen epämuodostuman yhteydessä. Syringomyelian syntymekanismi on vielä epäselvä, mutta sen uskotaan kehittyvän aivo-selkäydinnesteen virtaamisen häiriön seurauksena. Parhaiten diagnoosiin päästään korkeakenttämagneettikuvauksella. Chiari-tyyppistä epämuodostumaa ja syringomyeliaa voidaan hoitaa oireenmukaisesti pääasiassa yhdistelmällä tulehduskipulääkkeitä ja pregabaliinia tai gabapentiinia, sekä kirurgisesti. Chiari-tyyppinen epämuodostuma, kallo-kaularankaliitoksen ahtauma ja syringomyelia aiheuttavat kivuksi tulkittavia oireita, käytösmuutoksia ja motorisia puutoksia. Kivuksi tulkittavia oireita ovat ääntely, pään ja naaman hankaaminen, koskettamisen ja harjaamisen välttely, katkonainen uni, haluttomuus kiivetä portaita tai hypätä, sekä kosketusarkuus. Kivuliailla koirilla on voimakkaampi brakykefalia kuin oireettomilla koirilla. Kipuun liitettyjä rakenteita ovat isoaivojen rostaalisten osien lytistyminen ja hajulohkojen ventraalinen kiertyminen, lyhyt kallonpohja ja korkea kallonmuoto, jyrkkä otsapenger, ydinjatkeen taipuminen ja ensimmäisen ja toisen kaulanikaman alueen yläpuolinen kompressio. Syringomyelialle tyypillinen oire on ilman raapiminen, jota todetaan koirilla nesteontelon ollessa halkaisijaltaan yli 4 mm. Motoriset puutokset voidaan neurologisessa tutkimuksessa paikallistaa nesteontelon aiheuttaman selkäytimen vaurion sijainnin mukaan. Käytösmuutosten uskotaan olevan seurausta kivusta. Chiari-tyyppisen epämuodostuman, kallo-kaularankaliitoksen ahtauman ja syringomyelian oireiden tunnistaminen auttaa eläinlääkäreitä diagnoosiin päätymisessä. Tunnistamalla oireisiin liitettyjä rakenteita voidaan pyrkiä välttämään ja suosimaan tiettyjä rakenteellisia piirteitä jalostuksessa. Näin voitaisiin pyrkiä välttämään kipua ja kärsimystä tulevissa sukupolvissa sellaisilla roduilla, joissa on todettu yleisesti Chiari-tyyppistä epämuodostumaa ja syringomyeliaa. Kallo-kaularankaliitoksen ahtauman osuutta oireiden aiheuttajana tulisi tutkia lisää.

Krooninen laihtuminen on epäspesifinen kliininen oire monissa hevosten sairauksissa. Laihtumisen taustalla voi olla patofysiologialtaan erilaisia aiheuttajia, kuten kehityksellisiä, infektiivisiä tai neoplastisia sairauksia sekä parasiittitartuntoja. Vaikka kroonisen laihtumisen on reportoitu olevan yleinen oire eri sairauksissa, sen prevalenssia ja insidenssiä ei ole tutkittu hevospopulaatiossa. Kirjallisuuskatsauksessa käsitellään yleisiä ja harvinaisia hevosten kroonisen laihtumisen taustalla olevia sairauksia ja oireyhtymiä sekä tilan evaluaatioon soveltuvia kliinisiä tutkimusmenetelmiä. Yleisimpiä taustalla olevia sairauksia tai oireyhtymiä ovat kroonisen tulehduksellisen suolistosairauden (inflammatory bowel disease, IBD) eri muodot, proteiinien menetystä aiheuttava enteropatia ja ripuli, suolistoparasiitit, peritoniitti ja vatsaonteloabskessit sekä hammasongelmat. Harvinaisia syitä hevosten kroonisen laihtumisen taustalla ovat mm. krooniset maksasairaudet, sydänsairaudet, kasvainsairaudet sekä krooninen munuaisvika. Kroonisen laihtumisen evaluaatiossa perusteellisten anamnestisten tietojen, huolellisen kliinisen yleistutkimuksen ja hematologian sekä seerumitutkimusten ohella hyödyllisiä ovat mm. ultraääni- ja röntgentutkimukset, imeytymistestit, peräsuolibiopsiat sekä vatsaontelonestetutkimus. Vatsaontelon ultraäänitutkimuksen avulla voidaan mitata suoliston liikkuvuutta ja suolenseinämän paksuutta sekä havaita mahdollisia effuusioita ja massoja. Rintaonteloröntgentutkimus on tarpeen neoplasioiden ja muiden kroonisten keuhkosairauksien poissulkemiseksi. Hiilihydraattien imeytymistä ohutsuolesta voidaan arvioida glukoosin tai D-xyloosin imeytymistestillä. Tulehdusmuutokset peräsuolibiopsioissa puolestaan heijastavat koko suoliston tilaa. Peritoneaalinesteen tutkimus voi antaa viitteitä esimerkiksi vatsaontelon kasvainsairaudesta. Eläinlääketieteellisen tiedekunnan kliinisen laitoksen ja yliopistollisen eläinsairaalan suureläinklinikan tutkimusprojektiin otettiin kroonisesta laihtumisesta ja / tai toistuvista koliikeista kärsineitä hevosia. Hevosille tehtiin laajat tutkimukset, jotka sisälsivät mm. D-xyloosin absorptiotestin, peräsuolibiopsioiden histologisen tutkimuksen ja vatsaontelon ultraäänitutkimusen. Yhteensä 32 hevosta tutkittiin, ja viidentoista hevosen painonmenetyksen katsottiin kuntoluokan perusteella olevan kroonista. D-xyloosin imeytymisen huippupitoisuus tässä ryhmässä oli normaalia alhaisempi 27 %:lla, ja 33 %:lla imeytyminen oli viivästynyt. Peräsuolibiopsioissa löytyi yleisesti muutoksia; 50 %:lla todettiin lievä tai kohtalainen eosinofiili-infiltraatio sekä mukoosassa että submukoosassa. Suurimmalla osalla kroonisesti laihtuneista hevosista tulehduksellisen suolistosairauden voitiin katsoa olevan painonmenetyksen aiheuttaja. Löydökset osoittavat että muun muassa D-xyloosin absorptiotesti, peräsuolibiopsiatutkimus, suoliston ultraäänitutkimus ja vatsaontelonestetutkimus ovat tehokkaita menetelmiä kroonisesti laihtuneiden hevosten evaluaatioon ja taustalla olevien gastrointestinaaliperäisten sairauksien diagnosointiin.

Clostridium botulinum is group of anaerobic rod shaped soil bacteria which causes serious food poisonings. It produces spores that can be found worldwide. The group is very heterogenic but the common thing to all C. botulinum bacteria is that they produce strong neurotoxin that causes paralysis and death. Human pathogens are C. botulinum types A, B, E, and F. Types C and D cause disease in animals. Aim of this study was to evaluate the prevalence of C. botulinum type A, B, E, and F spores in Finnish beef using multiplex PCR method. 53 samples of beef were processed in 2 separate pathways. Therefore 106 samples examined to search for C. botulinum types A B E and F with multiplex PCR. Process included sample pre-processes to eliminate PCR inhibitory substances and to concentrate C. botulinum cells. Results of the study were inconclusive. None of the beef samples were positive but the inoculated positive controls were working only half of the time in both pre-process pathways.

Clostridium botulinum on elintarvikevälitteinen patogeeni, joka tuottaa voimakkainta tunnettua myrkkyä botuliinitoksiinia. Botuliini on hermomyrkky, joka aiheuttaa botulismia sekä ihmisille että eläimille estämällä välittäjäaineen vapautumisen hermo-lihasliitoksessa. Hengityslihaksistoon edetessään botulismi on hoitamattomana mahdollisesti kuolemaan johtava sairaus. C. botulinum kannan ATCC 3502 botuliinitoksiinikompleksi koostuu toksiiniosasta (BoNT/A1), nonhemagglutiniiniosasta (NTNH) ja kolmesta hemagglutiniiniosasta (HA-17, HA-33 ja HA-70). Toksiinikompleksin osia koodaavat geenit sijaitsevat samassa lokuksessa ja muodostavat kaksi erillistä operonia. Operonien välissä sijaitsee geeni (botR), joka koodaa toksiinituotantoa säätelevää BotR-sigmatekijää. C. botulinum tuottaa itiöitä, jotka ovat ympäristössä hyvin kestäviä. Itiöitymisen pääsäätelijänä toimii Spo0A, joka aktivoituessaan aktivoi edelleen sigmatekijäkaskadin. Tässä säätelykaskadissa emosolun puolella itiöitymistä ohjaavia rakennegeenejä säätelevät SigE ja SigK, ja esi-itiön puolella SigF ja SigG. Tutkimus koostui kahdesta eri osasta. Tutkimuksen metodologisessa osassa I oli tarkoituksena arvioida pienistä bakteeripopulaatioista saatavaa RNA-määrää ja sen laatua. RNA:n tutkimusmenetelmiin vaaditaan tyypillisesti suuria määriä hyvälaatuista RNA:ta, ja menetelmästä riippuen tarvittava määrä vaihtelee 200 nanogrammasta 5:een mikrogrammaan. Tarkoituksena oli selvittää, kuinka paljon bakteerisoluja tarvitaan RNA-sekvensointiin ja RT-qPCR-menetelmään. Tutkimuksessa käytetyt bakteerisolupelletit säilytettiin -70°C:ssa ja niistä eristettiin RNA. Tutkimuksen biologisessa osassa II oli tarkoituksena vertailla kahden eri C. botulinum ATCC 3502 -kannan isolaatin transkriptioprofiilia toksiinituotantoon ja itiöitymiseen liittyvien geenien osalta. Isolaattien transkriptioprofiilin avulla saatiin tietoa siitä, mitkä geenit ilmentyvät solussa tietyllä ajanhetkellä. ATCC 3502 -kannan isolaatti tox+ tuottaa botuliinia, kun taas kannasta laboratorio-olosuhteissa spontaanisti mutatoitunut isolaatti tox- tuottaa botuliinia huomattavasti vähemmän. Neurotoksiinituotantokyvyn lisäksi myös isolaattien itiöitymiskyvyn tiedetään eroavan toisistaan. Tox--isolaatin itiöitymiskyky on aikaisempien tutkimusten perusteella heikentynyt. Tox+- ja tox--isolaattien aiempi genomianalyysi toi esiin tärkeitä eroavaisuuksia niiden genotyyppien ja fenotyyppien suhteen. Tox--isolaatin vaihtoehtoista sigmatekijää BotR koodaavasta geenistä (botR) löydettiin geenin lukukehyksen muuttava insertiomutaatio. Molemmat isolaatit (tox+ ja tox-) kasvatettiin identtisissä olosuhteissa (anaerobinen TPGY-liemikasvatusalusta, 37 °C), ja bakteereiden eri kasvuvaiheista eristettiin solunäytteet. Bakteerisoluista eristettiin RNA, jonka perusteella valmistettua cDNA:ta käytettiin templaattina kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa RT-qPCR-analyysissa. RT-qPCR-menetelmän avulla tutkittiin kohdegeenien (botA, ha33, spo0A, sigF, sigE ja sigG) ilmentymistä bakteerin eri kasvuvaiheissa. Referenssigeeninä käytettiin 16S rRNA:ta. Geenien esiintymiselle muodostettiin suhdeluvut, joiden perusteella isolaattien transkriptioprofiileja verrattiin toisiinsa. Tutkimuksen osion II tulokset osoittavat, että botuliinin rakennegeenien (botA ja ha33) ilmentyminen tox+-isolaatilla oli suurimmillaan 30–65-kertaisesti (p<0,05) suurempaa kuin tox--isolaatilla. Tuloksen avulla voidaan selittää aikaisemmissa tutkimuksissa havaittu ero isolaattien neurotoksiinituotannossa. spo0A-geenin ilmentyminen oli enimmillään noin 30-kertaisesti suurempaa tox+-isolaatilla kuin tox--isolaatilla, mutta ero ei ollut näin suuri eikä tilastollisesti merkitsevä solupopulaatioiden kaikissa kasvuvaiheissa. Itiöitymisen sigmatekijöitä koodaavien geenien (sigE, sigF ja sigG) kohdalla erot isolaattien välillä olivat suurempia kuin spo0A-geenin kohdalla. Geenien ilmentyminen oli yleisesti 20–30-kertainen tox+-isolaatilla tox--isolaattiin nähden. Saadun tuloksen avulla voidaan selittää isolaatin tox- heikentynyt kyky itiöityä. Toksiinituotannolla ja itiöitymisellä on siten todennäköisesti yhteisiä säätelymekanismeja ja/tai -signaaleja. Mutaatio BotR sigmatekijässä todennäköisesti vaikuttaa myös itiöitymisen säätelyyn. On todennäköistä, että C. botulinumin itiöitymisen säätelykaskadi osallistuu myös toksiinituotannon säätelyyn. Tutkimus antaa tärkeää lisätietoa C. botulinumin itiöitymisen ja toksiinituotannon säätelystä saman kannan eri tavoin käyttäytyvillä solupopulaatioilla. Tutkimuksen osiosta I saatujen tulosten perusteella bakteerisolujen ja niistä eristettävän RNA-määrän välille saatiin standardisuora. Saatua tietoa voidaan hyödyntää RNA-sekvensoinnin ja RT-qPCR:n tutkimuskäytössä. Saatujen tulosten avulla voidaan laskea halutun RNA-massan perusteella soluviljelmään tarvittava bakteerisolumäärä, tai vastaavasti kuinka suuri määrä RNA:ta on mahdollista saada tietyn kokoisesta bakteerisolupopulaatiosta. Tutkimuksen osiosta II saatujen tulosten perusteella C. botulinumin itiöitymisprosessi ja toksiinituotanto linkittyvät siis toisiinsa useaa eri reittiä pitkin, ja vaikuttavat näin toinen toisensa säätelyyn. Tärkeänä tekijänä niiden välillä useimmilla C. botulinum –kannoilla toimii vaihtoehtoinen sigmatekijä BotR, joka toksiinituotannon säätelyn lisäksi linkittyy myös itiöitymisprosessin säätelyyn mitä todennäköisimmin orpokinaasien välityksellä säätelemällä Spo0A:n fosforyloitumista.

Clostridium botulinum on anaerobisissa olosuhteissa kasvava grampositiivinen sauvabakteeri. Se tuottaa hermomyrkkyä, botulinumneurotoksiinia, joka voi aiheuttaa ihmisen tai eläimen elimistöön päästessään botulismi-nimisen sairauden. Botulismi voi johtaa hoitamattomana hengityslihasten halvaukseen ja kuolemaan. Bakteeri muodostaa epäsuotuisia olosuhteita kestäviä lepomuotoja, itiöitä, jotka voivat säilyä muun muassa elintarviketeollisuuden kuumennusprosesseissa ja kylmäsäilytyksessä. Säilytyksen aikana itiö voi muuttua takaisin lisääntymiskykyiseen muotoonsa ja alkaa tuottaa botulinumneurotoksiinia. C. botulinumin itiöitä esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, vesistöissä ja eläinten suolistoissa. Kuten moni muukin mikrobi, C. botulinumin itiöt voivat päätyä ympäristöstä elintarvikeketjuun. Kansainvälisiin tutkimuksiin perustuen itiöiden esiintyvyys valmisruokien liharaaka-aineissa on 0–10 %. Itiöitä on näytteissä ollut 2–4 itiötä/kg. Suomessa liharaaka-aineita ei ole tutkittu, mutta kalassa ja hunajassaitiöiden esiintyvyydet ovat olleet 5–40 %. Liharaaka-aineiden itiökontaminaation selvittäminen on tärkeää, jotta voidaan arvioida itiöiden valmisruokateollisuudelle asettamat riskit ja tarvittaessa optimoida valmisruokateollisuuden käytössä olevia valmistusprosesseja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, esiintyykö suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa C. botulinumin itiöitä. Tutkimuksessa käytettiin CEN ISO/TS 17919:2013 - standardimenetelmää, joka perustuu botulinumneurotoksiinigeenien (tyypit A, B, E ja F) osoittamiseen näytemateriaalista eristetystä bakteeri-DNA:sta reaaliaikaisella PCR-tekniikalla. Tutkimuksessa tutkittiin yhteensä 87 broilerin- ja sianlihanäytettä. Kansainvälisiin tutkimuksiin ja suomalaisiin kala- ja hunajatutkimuksiin perustuen hypoteesiksi asetettiin se, että myös suomalaisissaelintarvikeraakaaineissa voisi olla itiöitä eli yksi tai useampi tutkittava näyte noin 90 tutkittavasta näytteestä olisi botulinumneurotoksiinigeenin suhteen positiivinen. Kaikki tutkitut näytteet olivat botulinumneurotoksiinigeenin suhteen negatiivisia. Kontrollinäytteet antoivat positiivisen tuloksen, kun näytteisiin lisätyt itiömäärät olivat 3 itiötä/kg tai enemmän. Näytteissä oli näin ollen vähemmän kuin 3 itiötä/kg. Tutkimusten mukaan elintarvikkeet kontaminoituvat itiöillä jonkin verran, mutta tämän työn perusteella suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa näyttää esiintyvän vain vähän tai ei ollenkaan C. botulinumin itiöitä. Suuremman näytemäärän tutkiminen vahvistaisi negatiivisen tuloksen luotettavuutta ja auttaa arvioimaan lihapohjaisiin valmisruokiin liittyvää C. botulinum -riskiä.