Browsing by Title

Kirjallisuuskatsauksessa käsitellään hevosen hengitysteiden anatomiaa ja fysiologiaa, sekä COPD:n patogeneesiä, histopatologiaa ja kliinistä kuvaa. Lisäksi esitellään erilaisia COPD-potilaan tutkimuksessa käytettaviä; menetelmiä. Tutkimusosassa oli tarkoituksena selvittää, kuinka suuria vuodenaikaisvaihteluita yksittäisen hevosen hengitysteissä tapahtuu, sekä selvittää, mitkä tutkimusmenetelmät soveltuvat parhaiten COPD:n asteen arviointiin. Erityisesti kiinnitettiin huomiota trakealimanäytteiden entsyymiarvoihin. Tutkimusosuus suoritettiin Ypäjän Hevostaloudentutkimusasemalla. Kokeessa oli mukana 19 hevosta, joita seurattiin vuoden ajan n. kuuden viikon välein. Jokaisella tutkimuskerralla hevosille suoritettiin kliininen yleistutkimus, intrapleuraalisen paineen mittaus sekä endoskopointi. Endoskopoinnin yhteydessä hevosilta otettiin trakealimanäytteet, joista tutkittiin solukuva sekä tietyt entsyymipitoisuudet (NAGaasi, beeta-glukuronidaasi, trypsiini-inhibiittori, plasmiini ja plasminogeeni ). Verinäytteistätutkittiin mm. yleisimmät tulehdusparametrit (fibrinogeeni, leukosyytit ) sekä happiosapainearvot. COPD-oireiden vuodenaikaisvaihtelu oli selvästi havaittavissa. Sekä kliiniset oireet, että erilaiset COPD:n määrityksessä käytettävät parametrit olivat korkeimmillaan kevättalvella. Entsyymeistä beeta-glukuronidaasi osoittautui lupaavaksi parametriksi hevosten hengitystiesairauksien asteen määrityksessä. Beeta-glukuronidaasiarvot olivat merkitsevästi kohonneet silloin, kun hevonen oli intrapleuraalipaineen, veri-alveolieron ja trakealiman neutrofiilimäärän perusteella määritelty sairaaksi.

Clostridium perfringens on yleinen bakteeri ihmisten ja eläinten suolistossa sekä maaperässä. Se on anaerobi, gram-positiivinen sauvabakteeri, joka muodostaa kestäviä itiöitä. Osa C. perfringenseistä tuottaa CPE-enterotoksiinia, joka aiheuttaa ruokamyrkytysoireet. Noin 6 %:lta kaikista eristetyistä C. perfringens -bakteereista on löydetty CPE-enterotoksiinia koodaava cpe-geeni. CPE-enterotoksiini vapautuu ohutsuolessa bakteerin sporuloituessa ja se vahingoittaa ohutsuolen epiteeliä. Tämä johtaa vatsakipuihin ja ripuliin. Oireet alkavat 6-12 h ruokailun jälkeen ja kestävät 12-24 h. Ruokamyrkytykset seuraavat usein tilanteissa, joissa ruokaa on valmistettu suuri määrä etukäteen. Ruoka on jäähdytetty hitaasti ja uudelleenlämmitys on ollut riittämätöntä. Usein ruoan käsittelytilat ovat olleet riittämättömät valmistetun ja tarjoillun ruoan määrään nähden. Ruokamyrkytysten lähteenä on perinteisesti ollut liharuoka. On esitetty useita epäilyjä, mistä enterotoksiinia muodostavat C. perfringens -kannat voisivat joutua ruokaan. Yksi vaihtoehto on, että liha saa kontaminaation jo teurastusvaiheessa eläimen suolen sisällöstä. Broilereiden suolistossa sekä C. perfringensin suhteelliset kokonaismäärät että cpe-positiivisten C. perfringensien osuus on muita kotieläimiä korkeampi. Broilerin liha onkin yksi potentiaalinen C. perfringens -ruokamyrkytyksen vehikkeli ja on siksi kiinnostuksen kohteena. Cpe-positiivisen C. perfringensin esiintyminen suolensisältörikasteessa voidaan luotettavasti todeta nested PCR -menetelmällä. Menetelmä on erittäin herkkä: sen avulla pystytään toteamaan cpe-positiivisia C. perfringens -bakteerimääriä alle 10 pmy/g ulostetta. Broileriteurastamon tarkastuseläinlääkäri otti broilerin suolipakettinäytteet välittömästi teurastuksen jälkeen teuraslinjasta. Suolinäytteitä otettiin keskimäärin 50 näytettä/tuottaja viiden eri tuottajan linnuista. Näytteitä tutkittiin 249 kpl, joista 40:stä (16 %) löytyi cpe-geeni. Cpe-positiivisia näytteitä esiintyi eri tuottajien broilereilla 4-33 %:n välillä. Tämän perusteella suomalaisissa broilereissa esiintyy enterotoksiinigeenin suhteen positiivisia C. perfringens -kantoja, jotka saattavat kontaminoida broilerin ruhoja ja johtaa huolimattomien ruoanvalmistus- ja käsittelytapojen seurauksena ruokamyrkytykseen.

Clostridium perfringens on yleinen bakteeri maapallolla. Sitä esiintyy mm. maaperässä, pölyssä ja ihmisten sekä eläinten suolistossa. Se on gram –positiivinen, anaerobi sauvabakteeri, joka kykenee muodostamaan kestäviä itiöitä. Osalla C. perfringens –bakteereista on kyky tuottaa enterotoksiinia (CPE, Clostridium perfringens enterotoksiini), joka voi aiheuttaa ruokamyrkytyksen. On osoittautunut, että tällaisia cpe –geenin omaavia bakteereita on alle 5 % kaikista tutkituista C. perfringens –bakteereista. Ruokamyrkytys liitetään yleensä liharuokaan. Todennäköisenä pidetään, että ruho kontaminoituu teurastuksen yhteydessä. Ihmisen roolista cpe –positiivisen C. perfringensin kantajana on vain vähän tutkittua tietoa. Tässä tutkimuksessa selvitettiin cpe –positiivisen C. perfringensin esiintymistä elintarviketyöntekijöiden ulosteessa. Tutkimus on osa laajempaa cpe -positiivisen C. perfringensin reservuaaritutkimusta. Ulostenäytteet tutkittiin nested PCR –menetelmällä, jolla voidaan todeta cpe–geeni suoraan ulosterikasteesta. Menetelmä on erittäin herkkä; sen avulla voidaan todeta cpe–positiiviset C. perfringens –bakteerisolut, joiden määrä näytteessä on alle 10 pmy/g ulostetta. Lisäksi osa tuoreista ulostenäytteistä viljeltiin tryptoosi-sulfiitti-sykloseriini (TSC) –agarille ja näytteistä määritettiin C. perfringens –pitoisus NMKL:n (Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel) menetelmäehdotuksen mukaan. Tutkimuksessa käsiteltiin yhteensä 136 elintarviketyöntekijän ulostenäytteet, jotka oli kerätty kevätkesällä 2003. Kaikki näytteet tutkittiin nested –PCR:llä ja 69 näytteistä viljeltiin. Neljästäkymmenestä viljellystä näytteestä (58%) pystyttiin eristämään C. perfringens. Bakteerin pitoisuus vaihteli välillä 10 - 106 pmy/g. Sekä cpe–positiivisten että cpe-negatiivisten näytteiden C. perfringens –pitoisuus vaihteli samalla välillä. Kaksikymmentäviisi näytettä 136:sta (18,4%) osoittautui positiiviseksi cpe –geenin suhteen. Tutkimus osoittaa, että huomattava osa terveistä ihmisistä voi toimia cpe-positiivisen C. perfringensin reservuaarina.

Clostridium perfringens on yleinen bakteeri kaikkialla ympäristössä ja se kuuluu eläinten ja ihmisen suoliston normaaliflooraan. C. perfringens muodostaa itiöitä, jotka kestävät hyvin lämpöä, kylmyyttä ja kuivuutta. C. perfringensin A-tyyppi on yleinen ruokamyrkytyksen aiheuttaja kaikkialla maailmassa. Ruokamyrkytyksen oireet aiheuttaa C. perfringensin A-tyypin muodostama enterotoksiini. Enterotoksiinia vapautuu, kun bakteeri itiöityy ohutsuolessa. Enterotoksiini vahingoittaa ohutsuolen epiteelisoluja, ja seurauksena on äkillinen vatsakipu ja ripuli. Enterotoksiinin muodostusta koodaa cpe-geeni. PCR-menetelmällä voidaan luotettavasti tutkia, onko C. perfringens –kanta positiivinen cpe-geenin suhteen. Enterotoksiinipositiiviset C. perfringens –kannat ovat usein muita lämmönkestävämpiä. Niiden itiöt eivät tuhoudu, kun ruokaa kuumennetaan. Hidas jäähdytys ja epätäydellinen uudelleenkuumennus mahdollistavat bakteerin nopean lisääntymisen ruoassa. Lihan kontaminoitumista teurastamolla pidetään mahdollisena tartuntareittinä, sillä ruokamyrkytyksen taustalla on usein edellisenä päivänä valmistettu liharuoka. Tutkimuksessa määritettiin 61 sian ulostenäytteen C. perfringens –pitoisuus. Jokaisesta näytteestä pyrittiin kuumennuskäsittelyllä saamaan esiin lämmönkestävät kannat. Näytteistä 97% sisälsi C. perfringensiä ja 27%:ssa näytteistä oli lämmönkestäviä itiöitä. Näytteet olivat kuudelta eri tilalta ja ne oli otettu pääosin emakoilta. C. perfringens –pitoisuuksissa havaittiin sekä tila- että yksilökohtaista vaihtelua. C. perfringens –kantoja eristettiin näytteistä yhteensä 268. Kun kannat tutkittiin PCR:llä, kaikki osoittautuivat enterotoksiininegatiivisiksi.

Clostridium perfringens on gram-positiivinen, itiöitä muodostava, anaerobinen sauvabakteeri. Se on yleinen maaperässä ja ihmisten ja eläinten suolistossa. C. perfringens on yksi yleisimpiä ruokamyrkytyksen aiheuttajia maailmassa. Clostridium-sukuun kuuluu muitakin ihmisille ja eläimille vahingollisia bakteereja, jotka ovat yleisiä maaperässä. Näitä ovat mm. Clostridium botulinum ja Clostridium tetani. Ruokamyrkytyksen oireet ovat yleensä lievät, siksi kaikkia tapauksia ei edes raportoida. Oireisiin kuuluu tavallisesti ripuli, vatsakipu, ja harvemmin kuume ja oksentelu. Ruokamyrkytys liittyy usein joukkoruokailuun, missä ruokaa ei ole kuumennettu kunnolla. Yleensä kyseessä on liharuoka. Ruokamyrkytyksen aiheuttaa C. perfringensin tuottama enterotoksiini. Enterotoksiinia koodaa cpe-geeni, jota on todettu vain pienellä osalla kannoista. Enterotoksiinipositiivisten kantojen esiintymistä on määritetty eläinten ulosteista ja lihasta, joissa sen esiintyminen on vaihdellut, mutta maaperästä ei ole juuri tehty tutkimuksia. Tämä tutkimus on osa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksen tutkimusprojektia, joka selvittää C. perfringensin epidemiologiaa. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, kuinka paljon maaperässä esiintyy enterotoksiinipositiivisia C. perfringens –kantoja, sekä vaikuttaako 15 minuuttia kestävä kuumennus 100 oC lämpötilassa enterotoksiinipositiivisten kantojen esiintymiseen. C. perfringensin eristämiseen ja varmistamiseen käytettiin Pohjoismaisen elintarvikkeiden metodiikkakomitean menetelmäehdotusta C. perfringensin määrittämiseen elintarvikkeista. Enterotoksiinipositiivisten kantojen esiintyminen tutkittiin PCR-menetelmällä. Tutkituista maanäytteistä (71) 88,7 % oli C. perfringensiä. Kantoja eristettiin 187 kappaletta, joista kuumennettuja oli kolme. Yhdestä näytteestä löytyi kaksi enterotoksiinipositiivista kantaa. Samasta näytteestä eristettiin myös kaksi negatiivista kantaa. Kuumennuksen vaikutusta enterotoksiinipositiivisten kantojen esiintymiseen ei pystytty arvioimaan, sillä kuumennetuista näytteistä ei löytynyt yhtään positiivista.

Tutkimamme bakteeri, Faecalibacterium prausnitzii kuuluu terveen aikuisen ihmisen normaaliin suoliston mikrobistoon yhtenä sen runsaslukuisimmista edustajista. Crohnin taudissa, johon liittyy suoliston mikrobiston epätasapainoa (dysbioosi), Clostridium leptum -ryhmään kuuluvan F. prausnitzii -bakteerin määrän on havaittu olevan normaalia alhaisempi. Kahdessa eri tutkimuksessa tavoitteenamme oli selvittää, miten F. prausnitzii -bakteerin tai sen aineenvaihduntatuotteiden tuominen ennakoivasti eläimeen vaikuttaa tulehduksen kulkuun ja vakavuuteen, sekä toimiiko hoito myös suolesta riippumatonta reittiä (intraperitoneaali-injektio) käyttäen. Mallintamiseen käytettiin trinitrobentseeni sulfonihappo- (TNBS) suolistotulehdusta hiirillä. Sekä Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin että sen aineenvaihduntatuotteita sisältävän kasvuliuoksen (supernatantti) osoitettiin hillitsevät tulehdusta TNBS-tulehdusmallissa hiirillä. Käyttämiemme tulehduksen arvosteluperusteiden mukaan molemmat hoidot näyttivät edesauttavan normaalin terveydentilan saavuttamista. Ne hillitsivät esitulehduksellisten sytokiinien tuotantoa sekä vaikuttivat suotuisasti suolenontelon mikrobilajiston tasapainoon koehiirten suolistotulehduksessa. Supernatantti myös lisäsi tulehdusta lievittävän interleukiinin, IL-10 tuotantoa Hoidot tehosivat myös sovelletussa TNBS-mallissa intraperitoneaaliruiskeena: hoidettujen hiirten kuolleisuus väheni kontrolliryhmiin nähden merkittävästi. Näin ollen bakteerin tai siitä valmistetun supernatantin ei tarvitse olla suolenontelossa vaikuttaakseen tulehdusta hillitsevästi.

Kaikki Cryptosporidium-sukuun kuuluvat alkueläimet ovat solunsisäisiä parasiitteja, jotka voivat infektoida yli 150 nisäkäslajin lisäksi myös lintuja, matelijoita, sammakkoeläimiä ja kaloja. Kryptosporideja esiintyy kaikkialla maailmassa. Tutkituin Cryptosporidium-laji on Cryptosporidium parvum, joka on varsinkin nuorten vasikoiden parasiitti. Muita naudoilla esiintyviä kryptosporidilajeja ovat Cryptosporidium bovis, Cryptosporidium ryanae ja Cryptosporidium andersoni. Kryptosporidioosiksi kutsutaan Cryptosporidium-alkueläimen aiheuttamaa tautia, jonka tyypillisin oire on itsestään rajoittuva lievä ripuli. Kryptosporidioosi diagnosoidaan etsimällä Cryptosporidium-alkueläimen ookystamuotoja ulostenäytteistä. Yleisimmin käytössä oleva menetelmä on joko värjättyjen tai värjäämättömien näytteiden mikroskopointi. Cryptospordium-alkueläimiä voidaan tutkia suoraan ulostenäytteistä, mutta yleensä näytteet konsentroidaan ennen varsinaista diagnosointia. Konsentrointimenetelmillä pyritään kasvattamaan ulostenäytteiden ookystien määrää suhteessa näytetilavuuteen, jolloin niiden havaitseminen helpottuu. Konsentrointi tapahtuu käyttämällä apuna erilaisia sentrifugointi- ja flotaatiomenetelmiä sekä tietyn tiheyden omaavia suola- tai sokeriliuoksia. Kryptosporideille on viime vuosina kehitetty myös useita polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvia molekylaarisia tunnistusmenetelmiä. Tutkimuksen tarkoituksena oli verrata keskenään Cryptosporidium-alkueläinten diagnostiikassa käytettäviä analyysimenetelmiä sekä kartoittaa kryptosporidien esiintymistä vasikoilla. Ulostenäytteet kerättiin vasikoiden kolmivaihekasvattamosta, jossa vasikat olivat keskimäärin alle kuukauden ikäisiä. 64 näytettä sisälsivät riittävästi ulostetta, jotta ne voitiin hyväksyä tutkimukseen. Tutkimuksen kokeellisessa osassa tarkasteltiin kolmea yleisimmin käytössä olevaa kryptosporidien konsentrointimenetelmää, jotka olivat natriumkloridiflotaatio, sokeriflotaatio ja formaliini-etyyliasetaattimenetelmä. Cryptosporidium-ookystien havaitsemiseen konsentroiduista ulostenäytteistä käytettiin sekä Ziehl-Neelsen värjäysmenetelmää että polymeraasiketjureaktiota (PCR). Kahdeksan kryptosporidien suhteen positiivista ulostenäytettä tyypitettiin DNA-sekvensoinnin avulla, jotta saatiin tietoa Suomessa esiintyvien Cryptosporidium-lajien prevalensseista. Analysoiduista 64 ulostenäytteestä 19 (29,7 %) oli PCR-menetelmällä kryptosporidien suhteen positiivisia. DNA-sekvensointiin valituista kahdeksasta näytteestä seitsemän oli genotyypiltään C. bovis ja yksi C. ryanae. Verratuista Cryptosporidium-alkueläinten diagnostiikassa käytettävistä menetelmistä Ziehl-Neelsen värjäys sopii varsinkin kliinisten näytteiden analysointiin, jotka sisältävät paljon ookystia. PCR-menetelmää kannattaa käyttää näytteille, joiden ookystamäärä on vähäinen tai joiden parasitologinen status halutaan selvittää laji- tai genotyyppitasolle asti. Tämän tutkimuksen perusteella kryptosporidien diagnostiikassa käytettävistä konsentrointimenetelmistä toimivin on natriumkloridiflotaatio, ja se voidaan ongelmitta yhdistää joko PCR-menetelmään tai Ziehl-Neelsen-värjäykseen.

Cryptosporidium on ympäristössä laajalle levinnyt, alkueläimiin kuuluva parasiitti. Organismi eristettiin ensimmäisen kerran vuosisadan alussa, mutta vasta muutamien vuosikymmenten ajan sen aiheuttama uhka sekä eläinten että ihmisten terveydelle on ymmärretty. Cryptosporidium on yksi Protozoa-pääjakson edustaja. Alajaksoista se kuuluu Sporozoiin, joten se liikkuu lähinnä lipumalla, ja elinkierto tapahtuu vakuoleissa suoliston epiteelin pinnallisimmassa kerroksessa. Lisääntyminen on sekä suvullista että suvutonta. Sporozoa-alajakso jakaantuu edelleen kolmeen luokkaan, joista Coccidia-luokka käsittää epiteelisolujen parasiitteja. Cryptosporidium-suku kuuluu tähän ryhmään. Suvun sisäisessä taksonomiassa esiintyy toistaiseksi vielä hurjasti epäselvyyksiä, sillä tämänhetkiset spesifikaatiokriteerit ovat riittämättömät vahvistamaan perinteisesti nimetyt lajit, ja geneettinen tietomäärä on tällä hetkellä vielä rajallista. Yleisesti on kuitenkin tunnettua, että lajeista Cryptosporidium parvum on ollut vastuussa lukuisista sekä kotieläinten että ihmisten kliinisistä sairaustapauksista. Erilaiset endoparasitaarisesti elävät prototsoat käyvät läpi myös elinvaiheen isännän ulkopuolella, ja koska nämä muodot pystyvät usein pitkiäkin aikoja selviämään ulkomaailmassa varsin epäsuotuisissakin olosuhteissa kuvataan niitä termillä kestomuoto. Näihin kestomuotoihin kuuluvat myös infektiiviset Cryptosporidium-ookystat, jotka resistenttisyytensä vuoksi aiheuttavat potentiaalisen sekä ympäristön kontaminaatiouhan että ongelman vedenkäsittelylaitoksille. Ihmisille tärkeimmät ookystalähteet lienevät infektoituneet kanssaihmiset, mutta myös lemmikki- ja hyötyeläimiä sekä laboratorioeläimiä on pidettävä mahdollisina ihmisten terveyttä uhkaavina tekijöinä. Ympäristöistä erityisesti ookystilla saastunut vesi on sisällytettävä potentiaalisten infektiolähteiden listaan. Mahdollisina tartuntalähteinä pidetään myös fomiitteja. Cryptosporidium parvumin roolia elintarvikeperäisenä patogeenina ei ole selvitetty riittävästi, mutta parasiitin epidemiologiset piirteet antavat aihetta olettaa kontaminoitujen elintarvikkeiden aiheuttamien kryptosporidioositapausten insidenssin olevan aliarvioidun. Tiedot kryptosporidioosista liittyvät voimakkaasti taloudellisesti merkittäviin tuotantoeläimiin. Kliinisistä infektioista kärsivät pääosin vastasyntyneet. Cryptosporidium parvum kykenee kuitenkin aiheuttamaan jopa henkeäuhkaavan, persistoivan, koleratyyppiseksikin luokitellun ripulin immuunijärjestelmän puutoksista kärsiville ihmisille. Toisaalta myös normaalit, aiemmin terveet henkilöt voivat sairastua. Organismin on todettu aiheuttavan sekä suuria taudinpurkauksia että sporadisia tapauksia ja turistiripulia. Kehitysmaissa sitä pidetään, jopa yhteisötasollakin, johtavana pitkittyneen ripulin aiheuttajana. Alkueläimet eivät lisäänny elimistön ulkopuolella, joten niiden osoittamisessa ollaan pitkälti turvauduttu suoriin menetelmiin. Vuosia organismin diagnosointi on perustunut ookystien osoittamiseen erilaisia värjäysmenetelmiä ja mikroskooppista tutkimusta hyväksikäyttäen. Muita menetelmiä ovat lähinnä immunodiagnostiset tekniikat. Molekyylibiologia on valtaamassa alaa myös parasiitteja tutkivissa laboratorioissa, ja jatkuvasti kehitelläänkin uusia nukleiinihapon detektointiin perustuvia, lähinnä polymeraasiketjureaktioon pohjautuvia menetelmiä myös Cryptosporidiumin diagnostiikassa. Työn tutkimusosassa perehdyttiin erilaisiin Cryptosporidium parvumin osoitusmenetelmiin. Sekä happovärjäysmenetelmä, immunofluoresenssiin perustuva tekniikka, IMS-esikäsittely ja PCR-menetelmä osoittautuivat kaikki melko työläiksi ja vaativiksi. Yhteenvetona voidaan todeta, että diagnostiikka ei ole ongelmatonta, ja uusien, kustannustehokkaiden, luotettavien ja yksinkertaisten menetelmien kehittely sekä saattaminen rutiinilaboratoriotutkimusten apuvälineiksi on toivottavaa.

Clostridium botulinum is an anaerobic rod shaped bacterium. It forms endospores that are commonly found in soils and aquatic sediments. C. botulinum produces one of the most potent neurotoxins that causes dangerous neuroparalytic disease called botulism. Food-borne botulism is an intoxication due to ingestion of preformed neurotoxin in foods. When favouring minimally processed food which safety depends almost only on chilled storage the risk of neurotoxin formation increases. It is essential to know the mechanisms of cold tolerance of C. botulinum when improving the safety of high-risk foods. A rapid temperature downshift causes decrease in the synthesis of most of the proteins in the cell. However the synthesis of structurally related cold shock proteins (Csp) reaches the maximum level after cold shock. It is assumed that these proteins are important for bacterial cold shock response. The exact function and meaning of cold shock proteins is not fully understood but they are believed e.g. to inhibit the formation of unwanted secondary structures of nucleic acids and regulate the synthesis of other proteins. The genome of C. botulinum ATCC 3502 strain contains three cold shock protein coding genes: cspA, cspB and cspC. The meaning of the cold shock proteins for the growth of ATCC 3502 was studied by comparing the growth of wild type strain and cspB- and cspC -mutant strains at different temperatures. The alterations in the expression of cspA-, cspB- and cspC -genes after cold shock were also studied. The results confirm that cspB and cspC genes are related to cold tolerance of the C. botulinum ATCC 3502 strain. cspB and cspC mutant strains grew at 20 °C at a reduced rate compared to C. botulinum ATCC 3502 wild type strain. There was no difference in growth rate between the strains grown at 37 °C and 44 °C. With quantitative RT-PCR, a significant twofold increase in the expression of cspA and cspB was detected for C. botulinum ATCC 3502 wild type strain while the expression of cspC stayed at normal level after cold shock. In cspB mutant strain the expression of cspA increased almost fivefold after cold shock. In cspC mutant strain after cold shock the trend of the expression of the other csp-genes was to decrease or stay at normal level. The results of quantitative RT-PCR method indicate some ability of csp genes to compensate for the functions of down regulated csp gene by other csp genes.

Inclusion bodies are intracellular limited aggregates that consist of subcellular components, such as proteins, that have folded incorrectly, accumulated, and not been eliminated by cells protective systems. Neuronal cytoplasmic inclusion bodies are formed in many human neurodegenerative diseases but have also been found in some canine neurodegenerative diseases. Malfunction of protein degradation systems has been linked to formation of inclusion bodies but the underlying purpose behind inclusion body formation is still often unknown. Lagotto Romagnolo (LR) is an old Italian dog breed. Several neurological diseases, such as benign familial juvenile epilepsy and cerebellar cortical abiotrophy, are known to occur among LR dogs. Eosinophilic neuronal cytoplasmic inclusion bodies have been discovered in brain samples of LR dogs with benign familial juvenile epilepsy and in LRs without clinical signs of disease. This licentiate thesis consists of a literature review and a histological study. The literature review introduces neuronal inclusion bodies and their known contents in general, as well as human and canine diseases linked to these inclusion bodies along with cellular processes that might be linked to the formation of inclusions. The most common staining methods used for neuronal inclusion bodies are also presented briefly. The study is a descriptive, retrospective study aiming to define the content of neuronal cytoplasmic inclusion bodies of LR dogs. The study material consisted of formalin-fixed, paraffin-embedded brain samples from four LR dogs that underwent autopsy at Section for Veterinary Pathology, University of Helsinki, from 2012 to 2018. One female dog with and three female dogs without neurological signs, all with a finding of intraneuronal cytoplasmic inclusions in the brain sections stained with hematoxylin-eosin-stain, were chosen for further stainings. The geniculate nuclei brain samples were stained histochemically for glycoproteins, lipoproteins, basic amino acids, and fibrin. Immunohistochemical stains used were ubiquitin, a-synuclein, β-amyloid, p62, LC3 and 1C2. The inclusions stained positively with Mallory phosphotungstic acid hematoxylin staining (PTAH) in all tested samples. PTAH is a histochemical stain with a high affinity to basic amino acids lysine, arginine, and histidine. Neuronal inclusion bodies that are positive on PTAH have been found as spontaneous age-related lesions in laboratory mice. In electron microscopy, the inclusion material was electron dense and finely granular with some small vesicular profiles without a limiting membrane. In conclusion, the neuronal inclusion bodies in geniculate nuclei of LR dogs in this study contain basic amino acids and not carbohydrates, lipids, or fibrinous material. The inclusion bodies are, however, not targeted for degradation as no p62, LC3 or ubiquitin signal was detected. Aggregation of a-synuclein or β-amyloid were also not detected within the inclusion.