Browsing by Title

Tämän lisensiaatintutkielman kirjallisuuskatsauksen tavoitteena on koota yhteen tämänhetkinen tutkimustieto Chiari-tyyppisen epämuodostuman, kallo-kaularankaliitoksen ahtauman ja syringomyelian yleisyydestä, etiologiasta, patogeneesistä, diagnostiikasta, oireista ja niihin liitetyistä kuvantamislöydöksistä, hoidosta ja ennusteesta, sillä tasolla, jolla kliinistä työtä tekevän praktikon olisi hyvä tuntea aihetta. Aihe on oleellinen uuden, etenkin oireita koskevan tutkimustiedon takia. Pienten brakykefaalisten koirarotujen suosion lisääntymisen myötä Chiari-tyyppisen epämuodostuman, kallo-kaularankaliitoksen ahtauman ja syringomyelian yleisyys koirapopulaatiossa saattaa lisääntyä, mikä lisää tarvetta tunnistaa näiden rakenteellisten poikkeamien aiheuttamat oireet. Chiari-tyyppiselle epämuodostumalle, kallo-kaularankaliitoksen ahtaumalle ja syringomyelialle alttiita ovat brakykefaaliset pienet rodut. Se on erityisen yleistä cavalier kingcharlesinspanielilla ja chihuahualla. Chiari-tyyppinen epämuodostuma on kallo-kaularankaliitoksen ja useiden kallon luiden kehityshäiriö, jossa kallon koko on suhteessa liian pieni aivojen kokoon nähden. Tämän seurauksena aivot järjestäytyvät kallon sisällä uudelleen ja pikkuaivot tyräytyvät niska-aukkoon. Chairi-tyyppisen epämuodostuman taustalla uskotaan olevan takaraivon rustoliitoksen liian aikainen luutuminen. Kallo-kaularankaliitoksen ahtaumassa kallon ja kaularangan luiset rakenteet ovat normaalia lähempänä toisiaan, ja alueen hermokudokselle jää normaalia vähemmän tilaa. Syringomyelia on selkäytimen nesteontelotauti, jota todetaan usein Chiari-tyyppisen epämuodostuman yhteydessä. Syringomyelian syntymekanismi on vielä epäselvä, mutta sen uskotaan kehittyvän aivo-selkäydinnesteen virtaamisen häiriön seurauksena. Parhaiten diagnoosiin päästään korkeakenttämagneettikuvauksella. Chiari-tyyppistä epämuodostumaa ja syringomyeliaa voidaan hoitaa oireenmukaisesti pääasiassa yhdistelmällä tulehduskipulääkkeitä ja pregabaliinia tai gabapentiinia, sekä kirurgisesti. Chiari-tyyppinen epämuodostuma, kallo-kaularankaliitoksen ahtauma ja syringomyelia aiheuttavat kivuksi tulkittavia oireita, käytösmuutoksia ja motorisia puutoksia. Kivuksi tulkittavia oireita ovat ääntely, pään ja naaman hankaaminen, koskettamisen ja harjaamisen välttely, katkonainen uni, haluttomuus kiivetä portaita tai hypätä, sekä kosketusarkuus. Kivuliailla koirilla on voimakkaampi brakykefalia kuin oireettomilla koirilla. Kipuun liitettyjä rakenteita ovat isoaivojen rostaalisten osien lytistyminen ja hajulohkojen ventraalinen kiertyminen, lyhyt kallonpohja ja korkea kallonmuoto, jyrkkä otsapenger, ydinjatkeen taipuminen ja ensimmäisen ja toisen kaulanikaman alueen yläpuolinen kompressio. Syringomyelialle tyypillinen oire on ilman raapiminen, jota todetaan koirilla nesteontelon ollessa halkaisijaltaan yli 4 mm. Motoriset puutokset voidaan neurologisessa tutkimuksessa paikallistaa nesteontelon aiheuttaman selkäytimen vaurion sijainnin mukaan. Käytösmuutosten uskotaan olevan seurausta kivusta. Chiari-tyyppisen epämuodostuman, kallo-kaularankaliitoksen ahtauman ja syringomyelian oireiden tunnistaminen auttaa eläinlääkäreitä diagnoosiin päätymisessä. Tunnistamalla oireisiin liitettyjä rakenteita voidaan pyrkiä välttämään ja suosimaan tiettyjä rakenteellisia piirteitä jalostuksessa. Näin voitaisiin pyrkiä välttämään kipua ja kärsimystä tulevissa sukupolvissa sellaisilla roduilla, joissa on todettu yleisesti Chiari-tyyppistä epämuodostumaa ja syringomyeliaa. Kallo-kaularankaliitoksen ahtauman osuutta oireiden aiheuttajana tulisi tutkia lisää.

Krooninen laihtuminen on epäspesifinen kliininen oire monissa hevosten sairauksissa. Laihtumisen taustalla voi olla patofysiologialtaan erilaisia aiheuttajia, kuten kehityksellisiä, infektiivisiä tai neoplastisia sairauksia sekä parasiittitartuntoja. Vaikka kroonisen laihtumisen on reportoitu olevan yleinen oire eri sairauksissa, sen prevalenssia ja insidenssiä ei ole tutkittu hevospopulaatiossa. Kirjallisuuskatsauksessa käsitellään yleisiä ja harvinaisia hevosten kroonisen laihtumisen taustalla olevia sairauksia ja oireyhtymiä sekä tilan evaluaatioon soveltuvia kliinisiä tutkimusmenetelmiä. Yleisimpiä taustalla olevia sairauksia tai oireyhtymiä ovat kroonisen tulehduksellisen suolistosairauden (inflammatory bowel disease, IBD) eri muodot, proteiinien menetystä aiheuttava enteropatia ja ripuli, suolistoparasiitit, peritoniitti ja vatsaonteloabskessit sekä hammasongelmat. Harvinaisia syitä hevosten kroonisen laihtumisen taustalla ovat mm. krooniset maksasairaudet, sydänsairaudet, kasvainsairaudet sekä krooninen munuaisvika. Kroonisen laihtumisen evaluaatiossa perusteellisten anamnestisten tietojen, huolellisen kliinisen yleistutkimuksen ja hematologian sekä seerumitutkimusten ohella hyödyllisiä ovat mm. ultraääni- ja röntgentutkimukset, imeytymistestit, peräsuolibiopsiat sekä vatsaontelonestetutkimus. Vatsaontelon ultraäänitutkimuksen avulla voidaan mitata suoliston liikkuvuutta ja suolenseinämän paksuutta sekä havaita mahdollisia effuusioita ja massoja. Rintaonteloröntgentutkimus on tarpeen neoplasioiden ja muiden kroonisten keuhkosairauksien poissulkemiseksi. Hiilihydraattien imeytymistä ohutsuolesta voidaan arvioida glukoosin tai D-xyloosin imeytymistestillä. Tulehdusmuutokset peräsuolibiopsioissa puolestaan heijastavat koko suoliston tilaa. Peritoneaalinesteen tutkimus voi antaa viitteitä esimerkiksi vatsaontelon kasvainsairaudesta. Eläinlääketieteellisen tiedekunnan kliinisen laitoksen ja yliopistollisen eläinsairaalan suureläinklinikan tutkimusprojektiin otettiin kroonisesta laihtumisesta ja / tai toistuvista koliikeista kärsineitä hevosia. Hevosille tehtiin laajat tutkimukset, jotka sisälsivät mm. D-xyloosin absorptiotestin, peräsuolibiopsioiden histologisen tutkimuksen ja vatsaontelon ultraäänitutkimusen. Yhteensä 32 hevosta tutkittiin, ja viidentoista hevosen painonmenetyksen katsottiin kuntoluokan perusteella olevan kroonista. D-xyloosin imeytymisen huippupitoisuus tässä ryhmässä oli normaalia alhaisempi 27 %:lla, ja 33 %:lla imeytyminen oli viivästynyt. Peräsuolibiopsioissa löytyi yleisesti muutoksia; 50 %:lla todettiin lievä tai kohtalainen eosinofiili-infiltraatio sekä mukoosassa että submukoosassa. Suurimmalla osalla kroonisesti laihtuneista hevosista tulehduksellisen suolistosairauden voitiin katsoa olevan painonmenetyksen aiheuttaja. Löydökset osoittavat että muun muassa D-xyloosin absorptiotesti, peräsuolibiopsiatutkimus, suoliston ultraäänitutkimus ja vatsaontelonestetutkimus ovat tehokkaita menetelmiä kroonisesti laihtuneiden hevosten evaluaatioon ja taustalla olevien gastrointestinaaliperäisten sairauksien diagnosointiin.

Clostridium botulinum is group of anaerobic rod shaped soil bacteria which causes serious food poisonings. It produces spores that can be found worldwide. The group is very heterogenic but the common thing to all C. botulinum bacteria is that they produce strong neurotoxin that causes paralysis and death. Human pathogens are C. botulinum types A, B, E, and F. Types C and D cause disease in animals. Aim of this study was to evaluate the prevalence of C. botulinum type A, B, E, and F spores in Finnish beef using multiplex PCR method. 53 samples of beef were processed in 2 separate pathways. Therefore 106 samples examined to search for C. botulinum types A B E and F with multiplex PCR. Process included sample pre-processes to eliminate PCR inhibitory substances and to concentrate C. botulinum cells. Results of the study were inconclusive. None of the beef samples were positive but the inoculated positive controls were working only half of the time in both pre-process pathways.

Clostridium botulinum on elintarvikevälitteinen patogeeni, joka tuottaa voimakkainta tunnettua myrkkyä botuliinitoksiinia. Botuliini on hermomyrkky, joka aiheuttaa botulismia sekä ihmisille että eläimille estämällä välittäjäaineen vapautumisen hermo-lihasliitoksessa. Hengityslihaksistoon edetessään botulismi on hoitamattomana mahdollisesti kuolemaan johtava sairaus. C. botulinum kannan ATCC 3502 botuliinitoksiinikompleksi koostuu toksiiniosasta (BoNT/A1), nonhemagglutiniiniosasta (NTNH) ja kolmesta hemagglutiniiniosasta (HA-17, HA-33 ja HA-70). Toksiinikompleksin osia koodaavat geenit sijaitsevat samassa lokuksessa ja muodostavat kaksi erillistä operonia. Operonien välissä sijaitsee geeni (botR), joka koodaa toksiinituotantoa säätelevää BotR-sigmatekijää. C. botulinum tuottaa itiöitä, jotka ovat ympäristössä hyvin kestäviä. Itiöitymisen pääsäätelijänä toimii Spo0A, joka aktivoituessaan aktivoi edelleen sigmatekijäkaskadin. Tässä säätelykaskadissa emosolun puolella itiöitymistä ohjaavia rakennegeenejä säätelevät SigE ja SigK, ja esi-itiön puolella SigF ja SigG. Tutkimus koostui kahdesta eri osasta. Tutkimuksen metodologisessa osassa I oli tarkoituksena arvioida pienistä bakteeripopulaatioista saatavaa RNA-määrää ja sen laatua. RNA:n tutkimusmenetelmiin vaaditaan tyypillisesti suuria määriä hyvälaatuista RNA:ta, ja menetelmästä riippuen tarvittava määrä vaihtelee 200 nanogrammasta 5:een mikrogrammaan. Tarkoituksena oli selvittää, kuinka paljon bakteerisoluja tarvitaan RNA-sekvensointiin ja RT-qPCR-menetelmään. Tutkimuksessa käytetyt bakteerisolupelletit säilytettiin -70°C:ssa ja niistä eristettiin RNA. Tutkimuksen biologisessa osassa II oli tarkoituksena vertailla kahden eri C. botulinum ATCC 3502 -kannan isolaatin transkriptioprofiilia toksiinituotantoon ja itiöitymiseen liittyvien geenien osalta. Isolaattien transkriptioprofiilin avulla saatiin tietoa siitä, mitkä geenit ilmentyvät solussa tietyllä ajanhetkellä. ATCC 3502 -kannan isolaatti tox+ tuottaa botuliinia, kun taas kannasta laboratorio-olosuhteissa spontaanisti mutatoitunut isolaatti tox- tuottaa botuliinia huomattavasti vähemmän. Neurotoksiinituotantokyvyn lisäksi myös isolaattien itiöitymiskyvyn tiedetään eroavan toisistaan. Tox--isolaatin itiöitymiskyky on aikaisempien tutkimusten perusteella heikentynyt. Tox+- ja tox--isolaattien aiempi genomianalyysi toi esiin tärkeitä eroavaisuuksia niiden genotyyppien ja fenotyyppien suhteen. Tox--isolaatin vaihtoehtoista sigmatekijää BotR koodaavasta geenistä (botR) löydettiin geenin lukukehyksen muuttava insertiomutaatio. Molemmat isolaatit (tox+ ja tox-) kasvatettiin identtisissä olosuhteissa (anaerobinen TPGY-liemikasvatusalusta, 37 °C), ja bakteereiden eri kasvuvaiheista eristettiin solunäytteet. Bakteerisoluista eristettiin RNA, jonka perusteella valmistettua cDNA:ta käytettiin templaattina kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa RT-qPCR-analyysissa. RT-qPCR-menetelmän avulla tutkittiin kohdegeenien (botA, ha33, spo0A, sigF, sigE ja sigG) ilmentymistä bakteerin eri kasvuvaiheissa. Referenssigeeninä käytettiin 16S rRNA:ta. Geenien esiintymiselle muodostettiin suhdeluvut, joiden perusteella isolaattien transkriptioprofiileja verrattiin toisiinsa. Tutkimuksen osion II tulokset osoittavat, että botuliinin rakennegeenien (botA ja ha33) ilmentyminen tox+-isolaatilla oli suurimmillaan 30–65-kertaisesti (p<0,05) suurempaa kuin tox--isolaatilla. Tuloksen avulla voidaan selittää aikaisemmissa tutkimuksissa havaittu ero isolaattien neurotoksiinituotannossa. spo0A-geenin ilmentyminen oli enimmillään noin 30-kertaisesti suurempaa tox+-isolaatilla kuin tox--isolaatilla, mutta ero ei ollut näin suuri eikä tilastollisesti merkitsevä solupopulaatioiden kaikissa kasvuvaiheissa. Itiöitymisen sigmatekijöitä koodaavien geenien (sigE, sigF ja sigG) kohdalla erot isolaattien välillä olivat suurempia kuin spo0A-geenin kohdalla. Geenien ilmentyminen oli yleisesti 20–30-kertainen tox+-isolaatilla tox--isolaattiin nähden. Saadun tuloksen avulla voidaan selittää isolaatin tox- heikentynyt kyky itiöityä. Toksiinituotannolla ja itiöitymisellä on siten todennäköisesti yhteisiä säätelymekanismeja ja/tai -signaaleja. Mutaatio BotR sigmatekijässä todennäköisesti vaikuttaa myös itiöitymisen säätelyyn. On todennäköistä, että C. botulinumin itiöitymisen säätelykaskadi osallistuu myös toksiinituotannon säätelyyn. Tutkimus antaa tärkeää lisätietoa C. botulinumin itiöitymisen ja toksiinituotannon säätelystä saman kannan eri tavoin käyttäytyvillä solupopulaatioilla. Tutkimuksen osiosta I saatujen tulosten perusteella bakteerisolujen ja niistä eristettävän RNA-määrän välille saatiin standardisuora. Saatua tietoa voidaan hyödyntää RNA-sekvensoinnin ja RT-qPCR:n tutkimuskäytössä. Saatujen tulosten avulla voidaan laskea halutun RNA-massan perusteella soluviljelmään tarvittava bakteerisolumäärä, tai vastaavasti kuinka suuri määrä RNA:ta on mahdollista saada tietyn kokoisesta bakteerisolupopulaatiosta. Tutkimuksen osiosta II saatujen tulosten perusteella C. botulinumin itiöitymisprosessi ja toksiinituotanto linkittyvät siis toisiinsa useaa eri reittiä pitkin, ja vaikuttavat näin toinen toisensa säätelyyn. Tärkeänä tekijänä niiden välillä useimmilla C. botulinum –kannoilla toimii vaihtoehtoinen sigmatekijä BotR, joka toksiinituotannon säätelyn lisäksi linkittyy myös itiöitymisprosessin säätelyyn mitä todennäköisimmin orpokinaasien välityksellä säätelemällä Spo0A:n fosforyloitumista.

Clostridium botulinum on anaerobisissa olosuhteissa kasvava grampositiivinen sauvabakteeri. Se tuottaa hermomyrkkyä, botulinumneurotoksiinia, joka voi aiheuttaa ihmisen tai eläimen elimistöön päästessään botulismi-nimisen sairauden. Botulismi voi johtaa hoitamattomana hengityslihasten halvaukseen ja kuolemaan. Bakteeri muodostaa epäsuotuisia olosuhteita kestäviä lepomuotoja, itiöitä, jotka voivat säilyä muun muassa elintarviketeollisuuden kuumennusprosesseissa ja kylmäsäilytyksessä. Säilytyksen aikana itiö voi muuttua takaisin lisääntymiskykyiseen muotoonsa ja alkaa tuottaa botulinumneurotoksiinia. C. botulinumin itiöitä esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, vesistöissä ja eläinten suolistoissa. Kuten moni muukin mikrobi, C. botulinumin itiöt voivat päätyä ympäristöstä elintarvikeketjuun. Kansainvälisiin tutkimuksiin perustuen itiöiden esiintyvyys valmisruokien liharaaka-aineissa on 0–10 %. Itiöitä on näytteissä ollut 2–4 itiötä/kg. Suomessa liharaaka-aineita ei ole tutkittu, mutta kalassa ja hunajassaitiöiden esiintyvyydet ovat olleet 5–40 %. Liharaaka-aineiden itiökontaminaation selvittäminen on tärkeää, jotta voidaan arvioida itiöiden valmisruokateollisuudelle asettamat riskit ja tarvittaessa optimoida valmisruokateollisuuden käytössä olevia valmistusprosesseja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, esiintyykö suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa C. botulinumin itiöitä. Tutkimuksessa käytettiin CEN ISO/TS 17919:2013 - standardimenetelmää, joka perustuu botulinumneurotoksiinigeenien (tyypit A, B, E ja F) osoittamiseen näytemateriaalista eristetystä bakteeri-DNA:sta reaaliaikaisella PCR-tekniikalla. Tutkimuksessa tutkittiin yhteensä 87 broilerin- ja sianlihanäytettä. Kansainvälisiin tutkimuksiin ja suomalaisiin kala- ja hunajatutkimuksiin perustuen hypoteesiksi asetettiin se, että myös suomalaisissaelintarvikeraakaaineissa voisi olla itiöitä eli yksi tai useampi tutkittava näyte noin 90 tutkittavasta näytteestä olisi botulinumneurotoksiinigeenin suhteen positiivinen. Kaikki tutkitut näytteet olivat botulinumneurotoksiinigeenin suhteen negatiivisia. Kontrollinäytteet antoivat positiivisen tuloksen, kun näytteisiin lisätyt itiömäärät olivat 3 itiötä/kg tai enemmän. Näytteissä oli näin ollen vähemmän kuin 3 itiötä/kg. Tutkimusten mukaan elintarvikkeet kontaminoituvat itiöillä jonkin verran, mutta tämän työn perusteella suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa näyttää esiintyvän vain vähän tai ei ollenkaan C. botulinumin itiöitä. Suuremman näytemäärän tutkiminen vahvistaisi negatiivisen tuloksen luotettavuutta ja auttaa arvioimaan lihapohjaisiin valmisruokiin liittyvää C. botulinum -riskiä.

Clostridium botulinum on gram-positiivinen itiöitä muodostava sauvamainen anaerobibakteeri, jota esiintyy yleisesti ympäristössä. C. botulinum tuottaa myrkyllisintä tunnettua yhdistettä, botuliinineurotoksiinia. Botuliinineurotoksiini aiheuttaa ihmisille ja eläimille botulismina tunnettua halvaussairautta, joka voi johtaa hoitamattomana jopa kuolemaan. Etenkin C. botulinum ryhmä II on elintarvikehygienian kannalta merkittävä, sillä ryhmän bakteerit kasvavat jääkaappilämpötiloissa, mikä aiheuttaa riskin jääkaapissa säilytettävien elintarvikkeiden turvallisuudelle. C. botulinum -bakteerin itiöinnin ja toksiinintuotannon geneettisiä säätelymekanismeja ei vielä tunneta täysin. Jotta voisimme saada lisää tietoa keinoista parantaa elintarvikkeiden turvallisuutta, on tärkeää saada lisää tietoa etenkin bakteerin toksiinintuotannosta. Koska on viitteitä siitä, että toksiinintuotannon ja itiöinnin välillä olisi yhteistä geneettistä säätelyä, on myös tärkeää saada lisää tietoa bakteerin itiöinnistä. Lisensiaatintutkielman tutkimusosassa tutkittiin uudella CRISPR-Cas9-menetelmällä valmistettuja kantoja. C. botulinum ryhmän II Beluga-kannasta oli yksitellen deletoitu geenit spo0A, sigK, orfX2 ja amyE. Tutkimuksessa selvitettiin, miten deleetio vaikuttaa bakteerien kasvuun, itiöintiin, toksiinintuotantoon ja solumorfologiaan. Bakteerikasvua seurattiin mittaamalla spektrofotometrilla optista tiheyttä sekä MPN (most probable number) -menetelmällä bakteerimääriä. Itiöintiä mitattiin kuumentamalla näytteitä vegetatiivibakteerien tuhoamiseksi ja edelleen MPN-menetelmällä. Toksiinintuotantoa mitattiin immunologisella ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) -testillä. Solujen morfologiaa tutkittiin gram- ja itiövärjäyksillä. spo0A ja sigK ovat keskeisiä itiöintiin vaikuttavia geenejä. Tutkimuksessa spo0A-geenimutantti (∆spo0A) ei itiöitynyt ollenkaan, ja spo0A-geenin deleetio vaikutti negatiivisesti bakteerien kasvuun. ∆sigK ei kyennyt itiöitymään, mutta itiövärjäyksessä havaittiin malakiittivihreällä värjäytyviä esi-itiöitä emosolujen sisällä. Todennäköisesti itiöinti on siis keskeytynyt vaiheessa IV, ja sigK-geeni säätelee itiöiden kuorikerroksen muodostumista. ∆sigK- ja ∆spo0A-kantojen toksiinintuotanto oli myös vähäisempää kuin mutatoimattoman kannan, mikä viittaa siihen, että toksiinintuotannon ja itiöinnin välillä on yhteistä geneettistä säätelyä. Molempien mutanttikantojen kohdalla toksiinia kertyi bakteerisolujen sisälle. Koska mutanttikannat eivät itiöityneet ollenkaan, saattaa olla, että normaali toksiininvapautus edellyttää nimenomaan tehokasta itiöitymistä. Tarvitaan kuitenkin jatkotutkimuksia, jotta saadaan entistä laajempi kuva bakteerien toksiininvapautusmekanismeista ja geneettisestä säätelystä. orfX2-geenin tehtävää ei tunneta, mutta epäillään, että se joko säätelee toksiinintuotantoa tai vastaa toksiinin rakenteellisen kompleksin proteiiniosan muodostumisesta. Tutkimuksessa havaittiin, että orfX2-geenin deleetio vaikutti sekä bakteerin itiöintiin että toksiinintuotantoon negatiivisesti. Lisäksi bakteerisolujen pidentynyt rakenne viittaa siihen, että bakteereilla oli jakaantumisongelmia. Tutkimuksen ∆orfX2-kannan deleetio oli kuitenkin tapahtunut epätäydellisesti, joten tästä johtuvat polarisaatiovaikutukset voivat olla mahdollisia. ∆amyE toimi tutkimuksessa kontrollikantana. amyE-geeni vaikuttaa tärkkelyksen pilkontakykyyn, joten deleetion ei oleteta vaikuttavan bakteerin toksiinintuotantoon tai itiöitymiseen. Tutkimustulokset olivat hypoteesin mukaisia.

Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.

Clostridium botulinum on gram-positiivinen itiöllinen anaerobinen sauvabakteeri. Epäsuotuisissa kasvuolosuhteissa bakteeri tuottaa lämpökestävän itiön. Bakteerin itiöitä esiintyy yleisesti maaperässä ja vesistöjen sedimenteissä. Clostridium botulinumin vegetatiivisten solujen tuottama toksiini on yksi vahvimmista myrkyistä ja se voi sairastuttaa sekä ihmisiä että eläimiä. Hevonen on erittäin herkkä botulinumtoksiinille. Maailmalla on raportoitu useita tapauksia, joissa pilaantunutta rehua syöneet hevoset ovat sairastuneet ja kuolleet myrkyn aiheuttamiin halvausoireisiin. Myös Suomessa on raportoitu botulismiepäilyjä, jotka ovat liittyneet pilaantuneen säilörehun syöttämiseen. Tässä tutkimuksessa selvitettiin C. botulinum tyyppien A, B, E ja F itiöiden mahdollista esiintymistä hevosen ulosteessa laidunkaudella. Työni liittyy osana tutkimukseen, jossa selvitetään C. botulinumin itiöiden esiintyvyyttä hunajassa. Mehiläisten tiedetään käyttävän vettä pesän lämmönsäätelyyn ja omaksi ravinnokseen. Tarvitsemansa veden mehiläiset hakevat lantaloista ja lantakasoista ja näin ollen on mahdollista, että hevosen uloste voisi toimia mahdollisena kontaminaatiolähteenä. Suomessa ei ole aikaisemmin tutkittu C. botulinumin itiöiden esiintymistä hevosen ulosteessa. Näytteet kerättiin eläinlääkäreiden ja eläinlääketieteen kandidaattien avustuksella sadalta hevoselta eri puolilta Suomea. Näytteenottotiloilla eläinlääkäri täytti hevosen omistajan tai tallinpitäjän avustuksella kyselykaavakkeen, jonka avulla selvitettiin mm. hevosten ruokintaa, vedensaantia ja laidunolosuhteita. C. botulinumin detektio tehtiin rikastuksen jälkeen multiplex-PCR –menetelmällä. Itiöiden määrä määritettiin MPN (Most Probable Number) –menetelmää käyttäen. Näytteistä punnittiin 1 g:n erissä kymmenen putken sarjat, joista positiivisen tuloksen antaneiden putkien lukumäärästä MPN-luku laskettiin. Käytetyllä menetelmällä hevosen ulostenäytteistä havaittiin C. botulinumin suhteen positiivisiksi 16 (16%) näytettä. Kaikki positiiviset näytteet sisälsivät tyypin B itiöitä. Tulos on sopusoinnussa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksella meneillään olevan tutkimuksen kanssa, jossa C. botulinum tyyppiä B todettiin esiintyvän Suomen maaperässä. Ulostenäytteistä löydettyjen itiöiden määrä vaihteli 11-69 kpl itiöitä/100 g näytettä keskiarvon ollessa 28 itiötä/100 g näytettä. Kyselytutkimuksen aineisto analysoitiin c2 –testin avulla. Kysyttyjen muuttujien suhteen ei havaittu tilastollisesti merkittäviä eroja positiivisten ja negatiivisten hevosten välillä (p>0,05). Tämän tutkimuksen perusteella hevosen uloste voi toimia mahdollisena kontaminaatiolähteenä hunajassa esiintyville C. botulinumin itiöille.

Clostridium botulinum on itiöitä muodostava gram-positiivinen sauvamainen anaerobibakteeri, jota tavataan yleisesti maaperässä ja vesistöissä ympäri maailmaa. Maaperästä ja vesistöistä se siirtyy helposti itiöidensä avulla kasveihin ja kaloihin, sekä myös muihin ihmisten käyttämiin elintarvikkeisiin. C. botulinum tuottaa lisääntyessään maailman myrkyllisimpänä aineena tunnettua neurotoksiinia, jota kutsutaan botulinumtoksiiniksi. C. botulinum jaetaan serotyyppeihin A, B, C, D, E, F ja G, joista tyypit A, B, E ja F ovat tavallisimpia humaanibotulismin aiheuttajia. Botulismia tavataan ihmisillä neljässä eri muodossa: klassinen ruokamyrkytysbotulismi, haavabotulismi, imeväisbotulismi sekä suolistobotulismi. Imeväisbotulismi on alle vuoden ikäisillä pikkulapsilla esiintyvä sairaus, joka aiheutuu C. botulinum –itiöiden germinoituessa ja tuottaessa toksiinia lapsen suolistossa. Sairaudella on erilaisia vakavuusasteita lievistä oireista äkkikuolemaan (kätkytkuolema) ilman edeltäviä oireita. Hunaja on toistaiseksi todettu ainoaksi vehikkelielintarvikkeeksi imeväisbotulismitapauksissa. C. botulinumin prevalenssia hunajassa on tutkittu useissa eri maissa ja itiöitä on todettu esiintyvän noin 0-20 %:ssa tutkituista näytteistä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää C. botulinum –itiöiden prevalenssia ruotsalaisessa hunajassa, sekä arvioida saadun tuloksen perusteella sisältääkö ruotsalaisen hunajan syöttäminen pikkulapsille imeväisbotulismiriskin. Hunajanäytteet (61 kpl) esikäsiteltiin ja tutkittiin multiplex-PCR-menetelmällä ja pyrittiin osoittamaan näytteissä mahdollisesti esiintyvä C. botulinum -serotyypin A, B, E tai F neurotoksiinigeeni. Tutkituista hunajanäytteistä löytyi vain yksi positiivinen näyte, jolloin C. botulinum –itiöiden prevalenssi ruotsalaisessa hunajassa on tämän tutkimuksen mukaan 2 %. Tulos vastaa suuruusluokaltaan muissa pohjoismaissa saatuja tuloksia. Löydetty C. botulinum –organismi oli serotyyppiä E. Näytteet olivat peräisin lingotusta hunajasta, joten suoraan mehiläispesistä tai kennostoista otetuissa näytteissä prevalenssi olisi saattanut osoittautua suuremmaksi. Saadun tuloksen perusteella voidaan siis ruotsalaisen hunajan syöttämisen alle vuoden ikäisille lapsille katsoa sisältävän imeväisbotulismiriskin. Alhaisen prevalenssin vuoksi riski on kuitenkin vähäinen.

Clostridium botulinum on yleinen bakteeri maaperässä ja vesistöissä. Se kasvaa anaerobisesti, eli se on erittäin potentiaalinen pilaaja säilykkeissä ja tyhjiöpakatuissa tuotteissa. C .botulinumin eristäminen näytteistä on aikaa vievää runsaan sekakasvun takia. Proteolyyttisten C. botulinumin -kantojen eristykseen on olemassa selektiivinen elatusaine, mutta ongelmaksi jää nonproteolyyttisten kantojen, kuten E-tyyppisten kantojen eristäminen, koska osa näistä kannoista ei kykene kasvamaan tällä elatusaineella. Tämän tutkimuksen tarkoituksena olikin kehittää C. botulinum tyyppi E:lle selektiivinen elatusaine, joka estäisi mahdollisimman monien näytteissä esiintyvien kontaminanttien kasvua. Tutkimuksessa käytettiin neurotoksiinia tuottavia C botulinum tyyppi E -kantoja ja negatiivisina vertailukantoina elintarvike- ja ympäristönäytteistä eristettyjä neurotoksiinia tuottamattomia pesäkemorfologialtaan C. botulinum tyyppi E:tä muistuttavia klostridikantoja. Kantojen neurotoksiinituotanto osoitettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Lääkeaineherkkyysmääritykset tehtiin agardiffunsiotekniikalla ja tarkoituksena oli löytää antibiootti, jolle C. botulinum tyyppi E olisi lähes resistentti, mutta jolle toksiinia tuottamattomat kannat puolestaan olisivat herkkiä. Lääkeaineherkkyysmäärityksissä todettiin C. botulinum tyyppi E:n kestävän toksiinia tuottamattomia kantoja paremmin seuravia antibiootteja: atstreonaami, kloksasilliini, kefiksiimi, kefotaksiimi, metisilliini, mesillinaami, penisilliini ja trimetopriimisulfa. Selektiiviseksi aineeksi valittiin kolmannen polven kefalosporiini, kefotaksiimi, jolle C. botulinum tyyppi E:n kannat olivat melko resistenttejä, mutta neurotoksiinia tuottamattomat negatiiviset vertailukannat olivat huomattavasti herkempiä. Kefotaksiimia lisättiin eri konsentraatioilla C. botulinumin eristyksessä käytettyyn elatusaineeseen (EYA = egg yolk agar). Kefotaksiimikonsentraatiot 5 ja 10 mg/1 agaria eivät sanottavasti heikentäneet C. botulinum tyyppi E:n kasvua, mutta estivät melko tehokkaasti kontaminanttien kasvua. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella olisi suositeltavaa käyttää C. botulinum tyyppi E:n eristämisessä selektiivistä kefotaksiimi agaria, jossa kefotaksiimikonsentraatio olisi 5 tai 10 mg/l agaria, pelkän EYA:n tilalla.