Browsing by Author "Ilves, Mika"

Keuhkohuuhtelunäytteiden (bronchoalveolar lavage, BAL) ottaminen koirilta ja hevosilta on yleisesti käytössä oleva diagnostinen menetelmä. Keuhkohuuhtelunäytteet soveltuvat lähinnä diffuusien keuhkomuutosten tutkimiseen. Paikallisten muutosten diagnosoimiseen menetelmä ei sovellu yhtä hyvin, eikä menetelmää voi tavallisesti käyttää bakteriologisten määritysten tekemiseen. Tavallisesti BAL-näytteen yhteydessä saatuja eukaryoottisoluja käytetään lähinnä sytologisiin määrityksiin. Huuhtelunäytteen sisältämien tulehdussolupopulaatioiden perusteella on mahdollista tehdä päätelmiä analysoitavan sairauden luonteesta ja vakavuudesta. Keuhkohuuhtelunäyteestä on perinteisesti määritetty mahdollisia patogeenimikrobeja ja -viruksia ja myöskin BAL-solujen tai BAL-huuhtelunesteen sisältämiä proteiineja tai peptidejä. Tosiaikainen kvantitatiivinen käänteiskopiointia hyödyntävä polymeraasiketjureaktio-menetelmä (RT-QPCR tai QPCR) on tehokas tapa solujen ilmentämien geenituotteiden määrän mittaamiseen. Menetelmä on yleisesti käytössä ja on syrjäyttänyt käytännössä kokonaan muut menetelmät, joita on aiemmin käytetty geenien ilmentämien tuotteiden kvantitointiin. QPCR-menetelmää on käytetty hevosten keuhkohuuhtelunäytteiden sisältämien eukaryoottisolujen geeniekspression tutkimiseen, sen sijaan julkaisuja koirien keuhkohuuhtelunäytesolujen analysointiin ei ole julkaistu. Julkaisuissa ei kuitenkaan ole yleensä tarkemmin kuvattu näytteiden ottamiseen, tutkittavan ribonukleiinihapon (RNA) eristämiseen tai muihin vaiheisiin liittyviä työvaiheita taikka vaiheisiin liittyviä ongelmakohtia. Yleisimmin tutkimuksen kohteena ovat olleet inflammaatiotapahtumassa mukana olevat geenit kuten eri interleukiinit ja kasvutekijät. Tämä kirjallisuuskatsauksen muodossa esitettävä lisensiaatintyö luo katsauksen hevosten ja koirien keuhkohuuhtelunäytteiden käsittelymenetelmiin, ja työssä esitetään aiempien julkaisujen ja Eläinlääketieteellisen tiedekunnan tutkijoiden kanssa käytyjen keskustelujen perusteella menetelmäehdotuksia keuhkohuuhtelunäytteiden ottamiseen ja niiden käsittelemiseen. Näiden ehdotusten avulla on mahdollista määrittää luotettavasti huuhtelunäytteiden sisältämien eukaryoottisolujen ilmentämien geenituotteiden määrä kvantitatiivisella PCR:llä. Suositeltavana menetelmänä on TaqMan®-kemiaan perustuva menetelmä. Näytteiden käsittelyn vaiheet kuten nukleiinihappojen eristäminen, käänteiskopiontireaktio ja itse polymeraasiketjureaktioajo pystytään suorittamaan tavanomaisilla kaupallisesti saatavilla olevilla pakkauksilla niiden valmistajien ohjeita seuraamalla. Edellä mainittujen ehdotusten mukaisesti määritettäessä keuhkohuuhtelunäytesolujen ekspressiotuotteita kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla tulee eniten huomiota kiinnittää realistiseen koejärjestelyyn sekä huolelliseen näytteenottoon ja sitä seuraavaan RNA:n eristämisvaiheeseen. Yksittäisistä vaiheista juuri RNA:n eristämisen yhteydessä tapahtuvat virheet muodostavat suurimman virhelähteen. Lisäksi huomiota tulee kiinnittää realistiseen tutkimussuunnitelmaan, käytettäviin TaqMan®-koettimiin olivat ne sitten itse suunniteltuja tai kaupallisesti hankittuja sekä saatujen tulosten merkittävyyteen.