Browsing by Author "Lahti, Meeri"

Clostridium botulinum on itiöivä sauvabakteeri, joka tuottaa kasvunsa aikana vahvinta biologista myrkkyä, botulinumneurotoksiinia. Toksiini aiheuttaa ihmisille ja eläimille velttohalvausta, jota kutsutaan botulismiksi. Botulismissa neurotoksiini estää motoristen hermopäätteiden välittäjäaineen vapautumisen, josta seuraa etenevä lihashalvaus. Hoitamattomana botulismi voi edetä hengityslihasten halvaantumiseen ja kuolemaan. C. botulinum –kasvustoissa havaitaan stationäärivaiheessa usein voimakas soluhajoaminen, joka selittyy osin itiöitymisellä ja osin vegetatiivisten bakteerien kuolemalla. Myös solunulkoisen toksiinin määrä on suurin stationäärivaiheessa, jonka vuoksi toksiinituotannon ja soluhajotuksen uskotaan olevan yhteydessä toisiinsa. Bakteerien soluhajoamiseen on liitetty laaja entsyymiryhmä, peptidoglykaanihydrolaasit, jotka purkavat bakteerien soluseinää. Mahdollisia peptidoglykaanihydrolaaseja koodaavia geenejä on C. botulinumin ja muiden klostridien genomeissa, mutta vastaavien proteiinien toimintaa tai spesifisyyttä ei tunneta. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää kuuden C. botulinumin genomin koodaaman mahdollisen peptidoglykaanihydrolaasin osallisuutta C. botulinum -ryhmän II tyypin E1 Beluga -kannan soluhajotukseen. Kunkin peptidoglykaanihydrolaasigeenin sisältävä kaupallinen plasmidi siirrettiin Escherichia coli -viljelmiin ja tuotetut proteiinit eristettiin nikkeliaffiniteettikromatografia-menetelmällä. Myöhäisestä logaritmisesta kasvuvaiheesta eristettyjä C. botulinum -soluja sisältäviin soluliuoksiin lisättiin puhdistettuja proteiineja ja liuosten soluhajoamista seurattiin mittaamalla optista tiheyttä (600 nm). Kontrolleina käytettiin käsittelemätöntä C. botulinum –soluliuosta sekä C. botulinum –soluja tehokkaasti hajottavaa kananmunan valkuaisen lysotsyymientsyymiä. Lisäksi solujen morfologiaa ja hajoamista arvioitiin mikroskopian avulla. Kuudesta mahdollisesta peptidoglykaanihydrolaasista neljä saatiin eristettyä ja puhdistettua. Näistä yksi (CLO_RS04280) hajotti ryhmän II C. botulinum –soluja merkittävästi kontrolliin verrattuna. Muilla tutkituilla proteiineilla ei havaittu vastaavaa vaikutusta tai soluhajotus oli epätäydellistä. Mikroskopia vahvisti soluhajotuskokeiden tulokset. Proteiinin CLO_RS04280 spesifisyyttä tutkittiin edelleen useissa ryhmien I ja II C. botulinum –kannoissa ja sen todettiin olevan spesifinen ryhmän II bakteerisoluille. Proteiinilöydös on merkittävä, sillä C. botulinumin soluhajotukseen liittyviä entsyymejä ei ole ennen eristetty ja puhdistettu. C. botulinum –soluja spesifisesti hajottavien entsyymien eristäminen antaisi uusia työkaluja botulismitutkimukseen, ja mahdollisesti bakteerien hajottamiseen niin botulismin hoidossa kuin elintarvikkeiden turvallisuuden varmistamisessakin. Tästä syystä tulevaisuudessa olisi syytä tutkia yksityiskohtaisemmin CLO_RS04280 entsyymitoimintaa ja sen aktiivisuutta muihin C. botulinum -kantoihin, sekä jatkaa tutkimuksia muiden C. botulinumia hajottavien peptidoglykaanihydrolaasien löytämiseksi.