Browsing by Subject "ELISA"

Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.

Kiiliäisten (Oestridae) heimoon kuuluva poron ihosaivartaja, Hypoderma (= Oedemagena) tarandi, kansankielellä kurmu, kuuluu porojen yleisimpiin ja samalla taloudellisesti merkittävimpiin parasiitteihin. Tämä syventävien opintojen projekti käsittää kirjallisuusosan ja tutkimusosan. Kirjallisuusosassa tarkastellaan poron Hypoderma tarandi -loisen elinkiertoa, esiintymistä ja merkitystä porotalouden kannalta, hypodermoosin immunologiaa ja työssä käytettyjen immunologisten menetelmien (western blottaus, ELISA ja IgG:n puhdistus proteiini G:n avulla) yleisiä periaatteita. Tutkimustyö tehtiin vuosina 1998-2001 Eltdk:n patologian laitoksella. Tutkimuksessa kehitettiin serologisia menetelmiä Hypoderma-vasta-aineiden osoittamiseen poron seeruminäytteissä. Serologisten menetelmien käyttöönoton hyötynäkökohtia ovat hypodermoosin epidemiologisen tutkimuksen helpottaminen, mahdollisuus löytää ja hoitaa seropositiiviset porot tartunnan varhaisvaiheessa eli ennen kuin toukat ehtivät aiheuttaa terveydellisiä haittoja ja vuotavaurioita sekä mahdollisesti vain tartunnan saaneiden porojen lääkitseminen. Tulevaisuudessa preventiivisen rokotteen kehittämiseen lähdettäessä tarvitaan luotettavat menetelmät myös vasta-aineiden osoittamiseen. Tutkimuksessa käytettiin antigeenina L2-L3-vaiheen kurmutoukkia ja primäärisenä vasta-aineena poron seeruminäytteitä. Antiseerumina käytettiin EELA:n ja Eltdk:n patologian laitoksen yhteistyössä valmistamaa kani-anti-poroa. Kaupallista vuohi-anti-kania käytettiin tunnistamaan kanin seerumi. Negatiivisena kontrollina käytettiin Korkeasaaren metsäpeurojen sekä supikoirien seeruminäytteitä. Western blottauksen ja ELISA:n perusteella saatiin selkeät viitteet siitä, että käytetyssä L3-vaiheen kurmuantigeenissa oli valmiiksi kiinni poron IgG:tä. Kyseessä voi olla kurmun adaptoima selviytymiskeino, jolla loinen pakenee isäntäeläimen immuunipuolustusta päällystäytymällä isännän antigeenilla. On myös mahdollista, että toukka on absorboinut poron vasta-aineet vähentääkseen omaa antigeenisuuttaan. Toisaalta tulokset voivat kertoa myös humoraalisen vasteen tehottomuudesta loisen torjumisessa. Menetelmää edelleen kehitettäessä voidaan kurmussa olevat vasta-aineet osoittaa ja lokalisoida esimerkiksi immunohistokemiallisella värjäyksellä jääleikkeistä tai paraffiinivalun avulla. Kurmuantigeeni voidaan myös yrittää puhdistaa siinä kiinni olevista immunoglobuliineista, jotka estävät seeruminäytteissä olevien vasta-aineiden luotettavan jäljittämisen.

Tämä työ on tehty osana ELL Minna Rinkisen tutkimusta koiran suoliston puolustusjärjestelmästä ja eri muuttujien vaikutuksesta siihen. Tutkimusosuus suoritettiin vuosien 1998 ja 1999 aikana. Tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää sandwich-ELISA- tutkimusmenetelmä, jolla voitaisiin määrittää seerumin ja suolistotähystimen harjan avulla otetun pohjukaissuolen limakalvonäytteen immunoglobuliini A:n määrää. Syljen ja suolen limakalvonäytteiden IgA-määrät suhteutettiin kokonaisproteiinimäärään ja pyrittiin selvittämään, onko seerumin, syljen ja suolen IgA:n määrien välillä yhteyttä. Suoliston puolustus on monimutkainen ja monesta eri osatekijästä rakennettu. Limakalvoeritteiden tärkein vasta- aine on IgA. Suurin osa koiran IgA:sta on sekretorista IgA:ta, jota tuotetaan lähinnä ohutsuolen limakalvon imusolmukkeissa. Sekretorinen osa liitetään IgA-molekyyliin, ja eritetään suolen limakalvon läpi suolionteloon. Sekretorista IgA:ta (sIgA:ta) erittyy myös kyynelnesteeseen, sylkeen, maitoon ja sukupuolieritteisiin. Sekretorisen IgA:n tärkeimmät tehtävät ovat toimia ensivaiheen limakalvopuolustuksena suolessa, sitoen itseensä bakteereitä, makromolekyylejä ja muita antigeenejä, ja toimia anti- inflammatorisesti, säädellen muiden immunoglobuliinien toimintaa. Rakenteestaan johtuen sIgA kestää hyvin suolessa olevien proteolyyttisten entsyymien hyökkäykset ja on pitkäikäisempi kun muut vasta-aineet. Ihmisellä IgA-puutos yhdistetään usein heikentyneeseen vastustuskykyyn. Nämä ihmiset sairastuvat herkemmin ohutsuolen bakteeriylikasvuun ja ohutsuolitulehduksiin. Ihmisellä selektiivinen IgA-puutos on tavallisin immunologinen vajavuus. Koirilla epäillään vastaavaa immuunivajetta, mutta selvää todistetta tähän ei ole. Tutkimuksissa on todettu, että ohutsuolen bakteeriylikasvu on yleisempää sIgA-puutoksen yhteydessä myös koiralla. Tutkimuksessamme 20:lle terveelle koiralle suoritettiin suolistotähystys, jonka yhteydessä näytteenottoharjalla otettiin pohjukaissuolen limakalvosta harjanäytteitä. Kaikista koirista otettiin seeruminäytteet ja 12:sta koirasta otettiin sylkinäytteitä. Näytteet analysoitiin kaksoissandwich ELISA-tutkimuksen avulla. Merkittävä negatiivinen korrelaatio todettiin suolen IgA-kokonaisproteiinisuhteen ja seerumin IgA-määrän välissä. Seerumin IgA-määrä ei näin ollen ole pätevä mittari suolen sIgA-määrästä. Syljen IgA-kokonaisproteiinisuhde ei korreloinut suolinäytteistä saadun vastaavan suhteen kanssa. Syljenkään IgA-määrää ei näin ollen voida käyttää suolen sIgA-määrän mittarina. Tutkimuksemme osoittaa, että menetelmämme on toistettavissa ja yhdistettävissä tavanomaiseen suolistotähystykseen. Menetelmämme on tarkka, noninvasiivinen ja helposti uusittavissa oleva menetelmä sIgA:n mittaamiseen.