Browsing by Subject "NAGaasi"

Vuohitiloilla utaretulehdus vähentyä maidontuotantoa ja heikentää maidon laatua. Meijereille vuohenmaidon laatu on ongelma erityisesti juustonvalmistuksessa. Kliinisesti terveen vuohen maidossa usein esiintyvien koagulaasinegatiivisten bakteerien merkitys on kiistanalainen. Tämä syventävien opintojen tutkielma sisältää kirjallisuuskatsauksen ja tutkimusosan. Kirjallisuuskatsauksessa käsitellään vuohen utaretulehdusta, sen diagnosointia ja vuohen utaretulehduksen aiheuttajaorganismeja. Tutkimusosassa selvitettiin eri bakteerien merkitystä sekä kliinisessä että subkliinisessä vuohen utaretulehduksessa. Näytteet jaettiin kolmeen ryhmään sen mukaan olivatko näytteet peräisin kliinistä vai subkliinistä utaretulehdusta sairastavilta vuohilta vai vuohilta, joiden maitonäytteistä ei vuoden aikana eritetty kertaakaan utaretulehdusbakteeria. Eri bakteerien aiheuttamia maitomuutoksia mitattiin CMT-testin sekä NAGaasi- ja antitrypsiinipitoisuuden avulla. Tutkimuksessa S.aureus aiheutti eniten maitomuutoksia vuohen sekä kliinisessä että subkliinisessä utaretulehduksessa. S.aureus oli myös yleisin vuohenkliinisen utaretulehduksen aiheuttaja. Toinen tärkeä kliinisen utaretulehduksen aiheuttaja oli S.epidermidis, joka ei kuitenkaan nostanut CMT:n, NAGaasin ja antitrypsiinin arvoja yhtä selvästi kuin S.aureus. Yleisimmät vuohen subkliinistä utaretulehdusta aiheuttavat bakteerit ovat koagulaasinegatiivisia stafylokokkeja joista selvästi yleisin oli S.epidermidis (43,7%). Seuraavaksi yleisimpiä olivat S.intermedius (27,3%) ja S.hyicus (10,9%). S.aureus oli subkliinisen utaretulehduksen aiheuttajana 3,8%:ssa tapauksista. Tutkimuksessa osoittautui, että koagulaasinegatiiviset bakteerit pystyvät aiheuttamaan kudostuhoa infektoituneessa vuohen utareessa, joten niiden merkitystä vuohen utaretulehduksen aiheuttajana ei tule vähätellä

KNS-lajit ovat yleisin utaretulehduksen aiheuttaja lypsylehmillä, mutta niiden tunnistus lajitasolle ei vielä kuulu utaretulehduksen rutiinidiagnostiikkaan. Suomessa KNS-lajit aiheuttavat hieman alle puolet utaretulehduksista. Tämä tutkimus tehtiin, koska utaretulehdus on yksi lypsylehmän yleisimmistä tuotantosairauksista ja sillä on suuri taloudellinen merkitys tuotannon kannattavuuteen. Parikymmentä eri KNS-lajia on eristetty utaretulehduksen aiheuttajina. Yleisimpiä KNS-lajeja ovat S. chromogenes, S. simulans, S. epidermidis, S. xylosus ja S. haemolyticus. KNS-lajit voivat olla joko utaretulehduksia. KNS-lajien välillä on eroja antibioottiresistenssissä ja siinä kuinka voimakkaan tulehdusreaktion ne aiheuttavat. Utaretulehduksen indikaattoreita ovat maidon solupitoisuus ja N-asetyyli-β-D-glukosiminidaasi (NAGaasi) -entsyymin aktiivisuus. Maidon soluluku kertoo somaattisten solujen pitoisuuden millilitrassa maitoa. Maidon solupitoisuus nousee soluvälitteisen immuniteetin aktivoitumisen seurauksena. Maidon soluluvun nousu johtuu lähinnä neutrofiilien lisääntymisestä maidossa. NAGaasi on lysosomaalinen entsyymi, joka vapautuu maitoon utarekudoksen epiteelisoluista ja neutrofiileistä. NAGaasi vapautuu soluista tulehduksen aiheuttaman kudostuhon ja neutrofiilien hajoamisen seurauksena. Tämän alkuperäistutkimuksen sisältävän lisensiaatin tutkielman tavoitteena oli selvittää vaikuttavatko toisen KNS-lajit enemmän maidon solupitoisuuteen kuin toiset. Nollahypoteesi on, että KNS-lajien välillä ei ole eroja siinä, kuinka paljon ne vaikuttavat maidon solupitoisuuteen. Tutkimuksen aineisto oli kerätty vuonna 1995 utaretulehduksen yleisyyttä kartoittavan tutkimuksen (Myllys ym. 1995) yhteydessä. Näytteiden solupitoisuudet oli tutkittu virtaussytometrillä ja osasta maitonäytteistä oli määritetty NAGaasi-entsyymin aktiivisuus (Myllys ym. 1995). Bakteeri-isolaattien analysointi tehtiin veriagarviljelmästä MALDI-TOF MS-laiteella (Bruker Maldi Biotyper, Microflex LT, Bruker Daltonic Gmbh, Bermen, Saksa). Lajit, joita esiintyi alle kymmenessä näytteessä, laitettiin yhteen ryhmään ”muut”. S. hyicus ja S. agnetis ajateltiin tutkimuksessa samaksi lajiksi, sillä MALDI-TOF MS -menetelmä ei kykene erottamaan niitä toisistaan. Tilastollinen analyysi tehtiin SPSS-ohjelmistolla (IBM SPSS versio 25, Chicago, Yhdysvallat). Stafylokokkilajin vaikutusta maidon solupitoisuuteen ja NAGaasi-entsyymin aktiivisuuteen tutkittiin Kruskal-Wallis-testillä. Tilastollisesti merkitsevänä raja-arvona pidettiin p < 0,05. Yleisimmät stafylokokkilajit olivat S. epidermidis, S. simulans ja S. chromogenes. Maitonäytteen solupitoisuudessa löydettiin tilastollisesti merkitsevä ero (p < 0,05) viidentoista stafylokokkilajin tai -lajiryhmän välillä. Lajien sisäinen soluluvun vaihtelu oli suuri. S. simulans, S. agnetis ja S. hyicus nousivat esiin voimakkaimman utaretulehdusvasteen aiheuttajina. S. cohnii, S. chromogenes ja S. haemolyticus aiheuttivat edellä mainittuja lievemmän tulehdusvasteen ja S. epidermidis, S. warneri, S. xylosus sekä bakteeriryhmä ”muut” lievimmän tulehdusreaktion. NAGaasi-entsyymin aktiivisuudessa löytyi tilastollisesti merkitsevä ero S. simulans- ja S. chromogenes -bakteerien välillä. Tutkimustulokset olivat linjassa aiempien tutkimuksien kanssa siinä, mitkä KNS lajit ovat merkityksellisempiä ja mitkä vähemmän merkityksellisiä utaretulehduksen aiheuttajia.

N-acetyl-β-D-glucosaminidaasi (NAGaasi) on glykosidaaseihin kuuluva, solujen lysosomeissa esiintyvä entsyymi, jota vapautuu maitoon utaretulehduksen aikana vaurioituneista utareen epiteelisoluista, neutrofiileistä ja makrofageista. NAGaasientsyymiaktiivisuuden on useissa tutkimuksissa havaittu korreloivan utareen tulehdustilan ja maidon soluluvun (SCC) kanssa ja sitä on ehdotettu käytettäväksi utareen epiteelisolutuhon mittaamiseen yksinään tai yhdistettynä SCC:n määritykseen. Koska saostuminen ei häiritse NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden mittausta maidosta, entsyymiaktiivisuus ei muutu maitoa säilytettäessä ja entsyymin mittaaminen on melko yksinkertaista ja nopeaa, menetelmä vaikuttaisi sopivan hyvin seulontatestiksi piileville utaretulehduksille. NAGaasin käyttö on toistaiseksi rajoittunut tutkimuskäyttöön. Sen hyödyntämistä vaikeuttaa se, että terveille lehmille eri tutkimuksissa määritetyissä NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden viitearvoissa on suurta vaihtelua. NAGaasi-entsyymiaktiivisuus maidossa on useiden tutkimusten mukaan korkeampi silloin, kun tulehduksen on aiheuttanut jokin merkittävä patogeeni kuin silloin, kun tulehduksen taustalla on vähäpätöinen patogeeni. Lypsykauden vaiheen on havaittu vaikuttavan maidon NAGaasi-entsyymiaktiivisuuteen siten, että aktiivisuudet ovat korkeampia heti poikimisen jälkeen ja lypsykauden lopulla. On myös havaittu, että normaalimaidossa NAGaasi-entsyymiaktiivisuus on hieman korkeampi loppumaidossa kuin alkumaidossa. Poikimakerran vaikutuksista NAGaasi-entsyymiaktiivisuuteen on ristiriitaisia tutkimustuloksia. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli määrittää NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden viitearvot terveen sekä utaretulehdusta sairastavan lypsylehmän maidossa, sekä selvittää tulehduksen voimakkuuden, aiheuttajapatogeenin, poikimakerran ja lypsykauden vaiheen vaikutusta kyseisen entsyymin aktiivisuuteen maidossa. Tutkimusaineistossa oli mukana kaikkiaan 838 vuosina 2000–2010 otettua maitonäytettä 62 eri lypsykarjatilalta Suomesta ja Virosta. Normaalimaidon NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden viitearvot määritettiin yhdeksältä suomalaiselta lypsykarjatilalta kerätyistä 196 maitonäytteestä, jotka täyttivät asettamamme normaalimaidon kriteerit. Normaalimaidon kriteerit olivat seuraavat: SCC < 100 000, lehmällä ei ole utaretulehduksen oireita, poikimisesta on kulunut aikaa yli 30 vuorokautta ja edellisestä lypsystä yli 6 tuntia. NAGaasi-entsyymiaktiivisuus mitattiin modifioidulla Mattilan menetelmällä (Mattila 1985) vakioiduissa olosuhteissa. Aineisto analysoitiin käyttäen Stata Intercooler tilasto-ohjelman versiota 11.0 (Stata Corporation, Texas, USA). Maidon NAGaasientsyymiaktiivisuuteen terveessä neljänneksessä vaikuttavia tekijöitä tutkittiin lineaarisella sekamallilla, jossa sekoittavana tekijänä oli tila. SCC:n ja NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden korrelaatiota arvioitiin terveillä lehmillä, piilevää utaretulehdusta sairastaneilla lehmillä ja koko aineistossa. Korrelaatiot laskettiin Pearsonin korrelaatiokertoimella. Tilastollisesti merkitsevänä raja-arvona kaikissa analyyseissä pidettiin p < 0.05. Normaalimaidon NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden viitearvoiksi lehmillä, joilla poikimisesta oli kulunut yli 30 vrk, saatiin 0,09–1,04 pmol/min/μl maitoa. Verrattuna normaalimaidon NAGaasi-entsyymiaktiivisuuksien keskiarvoon (0,56) ja piilevää utaretulehdusta sairastaneiden lehmien NAGaasi-entsyymiaktiivisuuksien keskiarvoon (2,49), kliinistä utaretulehdusta sairastavien lehmien maidon NAGaasi-entsyymiaktiivisuus oli keskimäärin selvästi korkeampi (16,65). Keskiarvoissa oli selvä ero paikallisoireisten (12,24) ja yleisoireisten (17,74) lehmien välillä. Terveiden neljännesten maitonäytteistä määritetyn NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden ja SCC:n välillä ei havaittu korrelaatiota. Piilevässä utaretulehduksessa havaittiin positiivinen korrelaatio (0,74) maidon NAGaasientsyymiaktiivisuuden ja SCC:n välillä. NAGaasi-entsyymiaktiivisuuteen vaikuttivat tilastollisesti merkitsevästi SCC, poikimisesta kulunut aika ja poikimakerta. Eri patogeeniryhmien osalta havaitsimme, että neljänneksissä, joista eristettiin vähäpätöinen patogeeni, NAGaasi-entsyymiaktiivisuus oli selvästi matalampi kuin neljänneksissä, joista eristettiin merkittävä patogeeni. NAGaasi-entsyymiaktiivisuuden keskiarvoksi vähäpätöisille patogeeneille (KNS, koryneformi) saatiin 2,82 ja merkittäville patogeeneille (S. aureus, Str. uberis, Str, agalactiae, Str. dysgalactiae, E.coli) 16,87.

Farmakologian ja toksikologian oppiaineen ja sisätautiopin oppiaineen yhteistyönä haluttiin selvittää, miten lysosomaalisten entsyymien fluorometriset entsyymimääritykset sopivat ruuansulatuskanavan näytteiden tutkimiseen. Aiemmissa tutkimuksissa farmakologian ja toksikologian oppiaineessa on selvitetty, että E.coli bakteerin tuottaman -glukuronidaasiaktiviteetin pH optimi on korkeampi kuin vastaavan lysosomaalisen entsyymin. Työn tarkoituksena oli selvittää, voidaanko -glukuronidaasi ja NAGaasi entsyymien avulla diagnosoida ruuansulatuskanavan tulehdustauteja, kuten ripuleita. Tarkoituksena oli selvittää entsyymiaktiivisuuksien esiintymispaikat ruuansulatuselimissä ja suolistossa sekä selvittää voidaanko bakteeriperäinen ja lysosomaalinen entsyymiaktiivisuus erottaa toisistaan pH:n avulla. Beta-glukuronidaasi ja NAGaasiaktiivisuutta löytyi runsaasti haimasta, maksasta, sylkirauhasesta ja suoliston limakalvonäytteistä sekä ulostenäytteistä. Suolen sisältönäytteissä entsyymiaktiivisuudet olivat alhaiset. Näytteiden aktiivisuuksien vertaaminen toisiinsa tai muihin tutkimustuloksiin ei ole mahdollista, koska proteiinimääritystä näytteistä ei voitu tehdä rikkoontuneen pakasteen sulatettua näytteet. Entsyymiaktiivisuuksien absoluuttiset esiintymismäärät ruuansulatuskannavan eri alueilla jäivät varmuudella selvittämättä. Tässä tutkimuksessa eri pH:ssa suoritetut entsyymiaktiivisuusanalyysit kuvasivat samasta lähteestä peräisin olevaa entsyymiaktiivisuutta (r2=0.6-0.7), pH:n perusteella oli mahdotonta erottaa bakteeriperäinen entsyymiaktiivisuus lysosomaalisesta. Kuitenkin -glukuronidaasi ja NAGaasi-analyyseissä joidenkin koirien limakalvonäytteiden aktiivisuusarvot poikkesivat huomattavasti vastaavasta korrelaatiosuorasta. Koirien taustatietoja ei ollut käytettävissä, joten näiden poikkeavuuksien yhteyttä ruuansulatuskanavan sairauksiin ei voitu selvittää. Jatkotutkimuksissa suoliston biopsianäytteestä tulisi tehdä aerobi- ja anaerobi bakteeriviljely sekä histopatologinen tutkimus samanaikaisesti entsyymimäärityksen kanssa, jotta voitaisiin arvioida mistä aktiivisuus on peräisin. Terveiden koirien näytteitä täytyisi verrata virus-, bakteeri tai loistautia sairastavien näytteisiin. Bakteeriperäisen ja lysosomaalisen -glukuronidaasiaktiivisuuksien erottamiseksi pH:n avulla ruuansulatuskanavasta täytyisi tutkimus rajoittaa ohutsuolen alueelle, jossa bakteerimäärät ovat pienemmät ja bakteerilajit ja -lajien entsyymituotanto tunnetaan tarkemmin, kuten esimerkiksi ohutsuolen kraniaaliosaan. Entsyymiaktiivisuuksia tulisi verrata sopivaan standardiin, bakteeriviljelyn tulokseen ja eläinten taustatietoihin.