Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Browsing by Subject "Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)"

Sort by: Order: Results:

  • Cpe-positiivisen Clostridium perfringensin esiintyminen broilerin suolistossa ja kantojen geneettinen diversiteetti 
    Heinikainen, Emilia (University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2004)
    Clostridium perfringens on yleinen ruokamyrkytyksiä aiheuttava bakteeri. Ruokamyrkytyksen oireiden uskotaan johtuvan C. perfringensin tuottamasta enterotoksiinista (CPE). C. perfringens on yleinen ihmisten ja eläinten suolistossa sekä maaperässä, mutta vain noin 5 % eristetyistä kannoista on kantanut cpe-geeniä. Mahdollisina lähteinä ruokamyrkytyksissä pidetään liharuokia. Erityisesti suolensisältöä pidetään tärkeänä kontaminaation lähteenä lihaan. C. perfringensiä esiintyy yleisesti terveen broilerin suolistossa. Teurastusprosessin aikana broilerin suolensisältö voi levitä ja kontaminoida broilerin lihan sekä käsittely-ympäristön. Vain pieni osa C. perfringens-kannoista, jotka on eristetty nykytekniikoilla broilerin ulosteesta, on cpe-positiivisia. C. perfringensin geneettisestä diversiteetistä eli monimuotoisuudesta terveillä eläimillä ei ole paljon tietoa. C. perfringens-kantojen geneettisestä tyypityksestä olisi hyötyä epidemiologisiin tutkimuksiin. Tämä tutkimus oli osa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksen kesäkoulua 2004. Tutkimuksessa haluttiin selvittää kuinka suurella osalla teurastetuista broilereista Suomessa esiintyy cpe-positiivista C. perfringensiniä nested PCR-menetelmällä osoitettuna. Tyypityksen avulla cpe-positiivisista näytteistä tutkittiin geneettistä diversiteettiä eli C. perfringens-kantojen monimuotoisuutta parven sisällä sekä eri tuottajilta peräisin olevilla linnuilla. Kantojen cpe-positiivisuus osoitettiin käyttäen nested PCR-menetelmää. Kantojen geneettistä diversiteettiä tutkittiin PFGE:n avulla. Tässä tutkimuksessa sadasta broilerin suolensisältörikastenäytteestä seitsemän (7 %) tulkittiin cpe-positiivisiksi. Vain neljästä cpe-positiivisesta näytteestä saatiin eristettyä C. perfringens tyypitystä varten. Näistä neljästä näytteestä eristettiin yhteensä 38 isolaattia. Tyypitettyä saatiin kahdeksan isolaattia, jotka olivat peräisin kahdelta saman tuottajan broilerilta. Seitsemällä isolaatilla oli identtinen PFGE-profiili ja yksi oli läheistä sukua näiden kanssa. Loput isolaateista jäivät tyypittymättä todennäköisesti bakteerin tuottamien voimakkaiden DNaasien aiheuttaman DNA:n hajoamisen seurauksena.
  • Listeria monocytogeneksen esiintyminen suomalaisessa, raa'assa kalassa 
    Markkula, Annukka (University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 1999)
    Listeria monocytogenes pystyy aiheuttamaan vakavia elintarvikkeiden välityksellä leviäviä sairauksia immuunivajaille henkilöille, vanhuksille, pienille lapsille ja raskaana oleville. Listeriaa on eristetty monista elintarvikkeista. Pitkiä aikoja säilytettävät, kuumentamatta syötävät elintarvikkeet, sekä kuumennuskäsittelyjen jälkeen kontaminoituneet tuotteet ovat tyypillisiä riskielintarvikkeita herkille yksilöille. Listeriaa esiintyy yleisesti kalavalmisteissa. Tuotteet kontaminoituvat kalanjalostuslaitoksissa käsittelylinjoilla. Laitosten kontaminoitumisreittejä ei kuitenkaan tiedetä. Raakaa kalaa pidetään mahdollisena kontaminaatiolähteenä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, kuinka paljon suomalaisessa, raa'assa kalassa esiintyy Listeria monocytogenesta. 102 näytettä, jotka sisälsivät kahdesta viiteen kalaa, tutkittiin. Listeria-eristys tehtiin ISO 11290-1 -menetelmän mukaisesti. Lisäksi käytettiin kiinteää LMBA-elatusainetta (Listeria monocytogenes blood agar). ISO-menetelmän mukaisten ja LMBA-elatusaineen käyttöä Listeria spp:n ja L. monocytogeneksen eristämisessä verrattiin. Puhtaaksi viljellyistä Listeria-kannoista tehtiin multiplex-PCR (-polymeraasiketjureaktio) -tutkimus. Tällä haluttiin selvittää PCR:n luotettavuutta Listeria spp:n ja L. monocytogeneksen tunnistamisessa verrattun perinteiseen eristysmenetelmään. Neljästä kuuteen L. monocytogenes -isolaattia jokaisesta positiivisesta näytteestä tyypitettiin pulssikenttäelektroforeesilla (PFGE) kantojen biodiversiteetin selvittämiseksi. 10 %:sta kaloja eristettiin Listeria spp. ja 3 %:sta Listeria monocytogenes. Kala on siis mahdollinen Listeria-laitoskontaminaatioiden lähde. Kiinteä LMBA-elatusaine oli tässä tutkimuksessa Listeria spp:n eristämisessä vastaava kuin ISO-menetelmän mukaiset selektiivilevyt. LMBA:lla havaittiin L. monocytogenekselle tyypillinen -hemolyysi. LMBA:n käyttö nopeuttaa L. monocytogeneksen tunnistusta ISO-menetelmään verrattuna vuorokaudella, kun isolaattien jatkoviljely verilevylle hemolyysin toteamiseksi on tarpeetonta. Multiplex-PCR:llä tunnistettiin kaikki samat Listeria-positiiviset näytteet kuin perinteisellä menetelmällä. PCR on perinteisiä menetelmiä nopeampi, joten sen käyttö esim. epidemiatapauksissa on perusteltua. PFGE:llä jokaisen L. monocytogenes -positiivisen näytteen pulssityypit olivat erilaisia. Yhden näytteen isolaatit olivat samaa tyyppiä. Kaloissa esiintyvät L. monocytogenes -tyypit vaihtelevat, mikä voi selittää kalanjalostuslaitoksista eristettyjen tyyppien vaihtelun.
  • Listeria Monocytogenesis -kantojen karakterisointi pulssikenttäelektroforeesin avulla 
    Miettinen, Maria (University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 1997)
    Listeria monocytogenes on gram-positiivinen yleinen, luonnossa esiintyvä sauvabakteeri. Se voi aiheuttaa listerioosia, sekä ihmisille että eläimille. Riskiryhmitään kuuluvat raskaana olevat naiset, vastasyntyneet ja henkilöt, joiden vastustuskyky on heikentynyt. Oireet vaihtelevat aina raskaana olevien naisten lievistä flunssankaltaisista oireista vakaviin meningoenkefaliitteihin. Kuolleisuus listerioosiin on noin 30 8/. 80-luvulla pystyttiin osoittamaan listerioositartuntojen olevan lähinnä elintarvikeperäisiä. Psykrotrofina L. monocytogenes pystyy lisääntymään jääkaappilämpötilassa. Perinteisten mikrobiologisten tyypitysmenetelmien herkkyys ei riitä erottelemaan eri lähteistä olevia L. monocytogenes-isolaatteja. Uudempia, herkkyydeltään parempia menetelmiä tarvitaan selvitettäessä L. monocytogenes-tartunnan alkuperä ja tutkittaessa elintarviketeollisuuden kontaminaatioreittejä . PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) eli pulssikenttäelektroforeesi on molekyylibiologinen menetelmä, jota voidaan käyttää eri mikrobikantojen erotteluun. Tutkittavien isolaattien DNA eristetään ja pilkotaan eri restriktioentsyymeillä eli DNA:ta määrätyistä kohdista katkovilla entsyymeillä. Saadut DNA-kappaleet ajetaan agaroosigeelissä pulssikenttäelektroforeesilla, joka erottelee kappaleet koon mukaan. DNA-kappaleet visualisoidaan etidiumbromidilla ja UV-valon avulla "DNA. Geeli kuvataan UV-suodattimella varustetulla Polaroid-kameralla, jolloin "DNA-sormenjäljistä" saadaan pysyvä kuva. Niitä voidaan verrata toisiinsa ja jos isolastit ovat samanlaisia voidaan osoittaa tartuntaelintarvike, tai määrittää kontaminaatioreitti elintarviketeollisuudessa. Tutkimuksessa karakterisoitiin pulssikenttäelektroforeesin avulla 30 L. monocytogenes-isolaattia, jotka oli eristetty kuuden vuoden aikana samasta meijeristä. Tyypitys tehtiin restriktioentsyymeillää ApaI ja SmaI. ApaI:lla saatiin kuusi erilaista restriktioentsyymidigestioprofiilia (REDP),, samoin SmaI:lla. Yhdistelemällä kahden eri entsyymin antamat REDP:it saatiin kahdeksan eri PFGE-tyyppiä, joista yhtä tyyppiä oli 60 % L. monocytogenes-isolaatista. Samaa päätyyppiä löytyi meijerin tuotteista tuotantoympäristöstä ja -koneista. Muita PFGE-tyyppejä esiintyi yksittäisinä löydöksinä. Tulokset viittaavat meijerissä eniten esiintyvän PFGE-tyypin adoptoituneen meijeriymparistöön ja kontaminoivan tuotteita satunnaisesti.
  • Salmonella Newport -epidemioiden tartuntalähteen selvittäminen molekyyliepidemiologisin menetelmin 
    Koort, Joanna (University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2003)
    Salmonella Newport on yleensä harvinainen salmonelloosin aiheuttaja Suomessa, vuonna 1996 niitä oli vain 1,3 % kaikista ihmisten salmonellooseista. Joulukuun 1997 ja tammikuun 1998 välisenä aikana kuitenkin havaittiin selvä nousu kotimaisten ihmistapausten määrässä. Tapaukset ilmaantuivat kahtena hautajaisiin liittyneenä Etelä- ja Pohjois-Suomessa, sekä useina yksittäisinä tapauksina ympäri Suomea. Epidemian selvittämiseksi kaikkiaan 56 kantaa valittiin tähän tutkimukseen. Näistä 22 oli epidemia-ajalta (joulukuu 1997 – tammikuu 1998). Vertailukannoiksi valittiin 27 ihmisperäistä kantaa vuosilta 1995–1998 (epidemia-ajan ulkopuolelta) KTL:n samonella-kantakokoelmasta. Viisitoista näistä kannoista oli kotimaisia ja kaksitoista ulkomaisia (eristetty henkilöistä, jotka olivat oleskelleet ulkomailla ennen sairastumistaan). Lisäksi EELA:sta oli saatavissa seitsemän ulkomaisesta tuontilihasta tai lihatuotteesta eristettyä kantaa. Tutkimuksessa epidemiologisina menetelminä käytettiin pulssikenttäelektroforeesia (PFGE) ja ribotyypitystä. Tutkituista 56 kannasta 49 tyypittyi perus-PFGE-menetelmällä. Loput seitsemän vaativat sovelletun menetelmän, jossa elektroforeesin Tris-pitoinen ajopuskuri korvattiin HEPES-puskurilla. Kannat jakautuivat 29 erilaiseen PFGE-tyyppiin. Suurin osa (21/22) epidemiakannoista antoi täysin identtisen PFGE-kuvion. Muut kannat erosivat täysin epidemiatyypistä. Ribotyypityksessä kannat jakautuivat 14 erilaiseen tyyppiin. Kaikki epidemiakannat kuuluivat samaan tyyppiin, johon kuuluivat lisäksi seitsemän ei-epidemiakantaa. Epidemiakantojen identtisyys sekä PFGE:ssa että ribotyypityksessä, yhdessä ei-epidemiakantojen suuren geneettisen vaihtelevuuden kanssa, viittaa voimakkaasti epidemiakannoille yhteiseen kontaminaatiolähteeseen. Epidemiologiset tutkimukset kahdesta hautajaisiin liittyneestä ryppäästä osoittivat assosiaation sianlihaan, mutta valitettavasti epäiltyjä ruoka-aineita ei ollut saatavissa viljeltäviksi eikä lähdettä pystytty varmistamaan.

Yhteystiedot

HELSINGIN YLIOPISTO