Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Browsing by Subject "RT-qPCR"

Sort by: Order: Results:

  • Sian norovirusten etsiminen suomalaisten sikojen ulosteesta ihmisten noroviruksia havaitsevalla reaaliaikaisella RT-PCR-testillä. 
    Mikkonen, Venla (2022)
    Norovirus on merkittävä ruuansulatuskanavan patogeeni, joka aiheuttaa ihmisillä vuosittain infektioita ympäri maailman. Norovirukset voidaan jaotella kymmeneen eri genoryhmään, joissa on pääasiassa lajispesifisiä infektion aiheuttajia. Genoryhmän II norovirukset aiheuttavat infektioita sekä sioille että ihmisille, mutta pääasiassa sian ja ihmisen norovirukset ovat kuitenkin eri genotyyppejä. Mielenkiinnon on herättänyt kyseisten genotyyppien geneettinen samankaltaisuus ja norovirustestien lajispesifisyys, sillä joissakin tutkimuksissa on todettu ihmisen norovirustestin antaneen positiivisia tuloksia sian noroviruksille. Noroviruksen 15216-2-ISO-standardin mukaisen genoryhmän II PCR (eng. polymerase chain reaction)-testin tavoitteena on havaita noroviruksen genomi riskielintarvikkeista, kuten marjoista ja hedelmistä. Pääsääntöisesti testi on suunniteltu havaitsemaan ihmisten noroviruksia. Tässä alkuperäistutkimuksessa keskityttiin selvittämään noroviruksen 15216-2-ISO-standardin noroviruksen genoryhmän II mukaisten alukkeiden lajispesifisyyttä reaaliaikaisella RT-PCR (eng. reverse transcriptase polymerase chain reaction)-testillä, sillä aiempien tutkimuksien tulokset ovat herättäneet jatkotutkimuksen tarpeen. Ennen tutkimuksen tekoa uskoimme ristireaktioiden olevan mahdollisia genoryhmän II sian ja ihmisen koroviruksien samankaltaisen genomin vuoksi. Tutkimuksemme on tietääksemme ensimmäinen, jossa tutkitaan ihmisen genoryhmän II noroviruksille säädetyn 15216-2-ISO-standardin lajispesifisyyttä sian noroviruksen suhteen. Tutkimuksessa käytimme pakastettuja ja tuoreita sian ulostenäytteitä. Tutkimme yhteensä 100 testattavaa ulostenäytettä, yhden sian norovirukselle positiiviseksi todetun ulostenäytteen sekä 11 sian ulostetta sisältävää jätevesinäytettä. Teimme ulosteista ulostesuspensiot ja eristimme suspensioista RNA:ta kaupallisen eristyssarjan avulla. Tämän jälkeen monistimme näytteessä mahdollisesti olevaa noroviruksen RNA:ta DNA:na reaaliaikaisen käänteiskopioinnin ja polymeraasiketjureaktion avulla. Tutkimme näytteitä kahdessa erilaisissa testiolosuhteissa. 15216-2-ISO-standardin alukkeiden lisäksi testasimme positiivisen tuloksen antaneet ulostenäytteet ja kolme voimakkaimman tuloksen antanutta sian ulostenäytettä sisältävää jätevesinäytettä COG2R ja COG2F -alukkeilla. Saimme tutkimuksessamme 15216-2-ISO-standardin mukaisilla alukkeilla positiivisen tuloksen sian norovirukselle jo aiemmin sian norovirukselle positiiviseksi todetusta sian ulostenäytteestä. Lisäksi saimme positiivisia tuloksia seitsemästä muusta sian ulostenäytteestä ja yhdeksästä sian ulostetta sisältävistä jätevesinäytteistä kyseisillä alukkeilla. Kaikki seitsemän positiivisen tuloksen antanutta sian ulostenäytettä antoivat positiivisen tuloksen myös COG2R ja COG2F -alukkeilla. Kolme kyseisillä alukkeilla testaamaamme sian ulostetta sisältävää jätevesinäytettä antoivat positiivisen tuloksen. Tuloksemme tukevat ajatustamme siitä, että 15216-2-ISO-standardin mukainen RT-qPCR-testi havaitsee sian noroviruksia, sillä tutkimuksemme osoitti, että 15216-2-ISO-standardin mukainen RT-qPCR-testi voi antaa positiivisen tuloksen ainakin yhdelle sian noroviruksen genotyypille. Tutkimuksemme perusteella emme vielä osaa sanoa, antaako testi positiivisen tuloksen kaikille sian noroviruksen genoryhmän II genotyypeille, joten jatkotutkimuksissa positiivisen tuloksen antaneet näytteet sekvensoidaan tai muulla tavoin varmistetaan sian noroviruksiksi.
  • Yersinia pseudotuberculosiksen histidiinikinaasia RstB, hybridikinaasia EvgS sekä σE- ja σS-tekijöitä koodaavien geenien ilmentyminen 30 °C ja 5 °C lämpötiloissa 
    Sihto, Henna-Maria (University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2008)
    Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis are the third most common reported zoonoses after Campylobacter and Salmonella. Y. pseudotuberculosis has caused 10 outbreaks in Finland since 1997. The symptoms of yersiniosis include fever, right-sided abdominal pain and diarrhea. Post-infectious complications are common. Refrigeration is the most common modern food preservation method, however, as psychrotrophs, enteropathogenic Yersinia are able to grow at refrigerator temperatures. However, the mechanism behind psychrotrophy is still unknown. The aim of this study was to determine the expression levels of rstB, evgS and the genes coding for the σE- and σS-factors of Y. pseudotuberculosis IP 32953 at 30 °C and after temperature drop to 5 °C. Total RNA had been extracted before and 30 minutes, 3, and 7 hours after the temperature downshift for previously performed DNA microarray gene expression studies. Low temperature had been found to increase the expression levels of these genes in these studies. The gene expression levels were determined using real-time quantitative PCR (RT-qPCR). RNA-samples were reverse transcribed into complementary DNA (cDNA), which was used as a template in the qPCR-reactions. The gene expression levels at different time points were determined by measuring the signal emitted by the fluorescent dye. THE ∆∆Ct-method was used for relative quantification. The 16S rRNA (locus tag YPTB_RNA_102) was used for normalization. The expression levels of all the studied genes were approximately doubled 30 minutes after the cold shock demonstrating the significance of the genes in the immediate cold shock response. The expression levels were at highest 3 hours after the cold shock: 2,4-fold for rstB, 4,4-fold for evgS, 6,6-fold for sigmaE and 5,6-fold for rpoS compared with the expression level before the cold shock. The expression levels of all the four genes were decreased 7 hours after the cold shock illustrating adaptation to the lower temperature. The results confirm the findings of the DNA microarray gene expression experiments done previously in the research group. In the future the knowledge of the genes involved in the cold shock response can be utilized in controlling the growth of Y. pseudotuberculosis in foodstuffs.

Yhteystiedot

HELSINGIN YLIOPISTO