Browsing by Subject "genotyyppi"
Now showing items 1-4 of 4
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2005)Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2005)Vuonna 1995 kehitettiin DNA-mikrosiruihin perustuva menetelmä tutkia yhtäaikaisesti tuhansia geenejä. Menetelmää on siitä lähtien sovellettu monilla tieteenaloilla mm. syöpätutkimuksessa, lääkkeiden kehittämisessä ja genomiikan tutkimuksessa. Viimeisen kymmenen vuoden aikana on ilmestynyt lukuisia julkaisuja, jotka käsittelevät DNA-mikrosirutekniikan sovelluksia eri biotieteen aloihin. Tässä työssä luodaan yleiskatsaus DNA-mikrosirutekniikan perusperiaatteisiin sekä esitellään sen käyttöä elintarvikepatogeenien tutkimuksessa. Elintarvikepatogeenitutkimuksissa DNA-mikrosirutekniikkaa on käytetty lähinnä viiteen tarkoitukseen: diagnostiikkaan, genotyypitykseen, evolutiivisen genomiikan tutkimuksiin, geeniekspressiotutkimuksiin ja isäntä-patogeeni-vuorovaikutuksen tutkimiseen. DNA-mikrosirutekniikalla on nykyään useita variaatioita, mutta periaate on kaikissa sama: lastumaiselle tukimateriaalille, esimerkiksi mikroskooppilasille, on erittäin tiheään asetettu tutkittavia geenejä edustavat koettimet. Näytteen DNA-juosteet kiinnittyvät emäspariperiaatteen mukaisesti (A-T ja G-C) kukin omalle koettimelleen. Tämän pariutumistapahtuman tuloksia luetaan mikrosirulta ja analysoidaan. Näyte-DNA saadaan eristämällä tutkimuskohteesta DNA:ta tai RNA:ta, joka käännetään käänteistranskriptiolla komplementaariseksi DNA:ksi. DNA-mikrosirukokeeseen liittyy monia eri vaiheita: 1. Mikrosirun valmistus 2. Näytteen valmistus ja leimaus 3. Hybridisaatio 4. Tulosten lukeminen mikrosirulta 5. Tulosten käsittely ja analyysi 6. Koetulosten tulkinta DNA-mikrosirutekniikan suurimmat edut ovat sen tarkkuus ja nopeus. Geenit pystytään tunnistamaan ja erottamaan toisistaan tarkasti niiden spesifisen emäsjärjestyksen perusteella ja yhdellä kokeella saadaan tietoa koko genomista. Tekniikan ongelmat liittyvät toisaalta juuri valtavaan tietomäärään, jota on vaikea käsitellä ja tulkita sekä kokeen monivaiheisuuteen, mikä lisää virhemahdollisuutta. Lisäksi menetelmä on monilta osin vielä hyvin kallis.
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2007)Rotaviruses are double-stranded RNA-viruses. They are members of the family Reoviridae and are the cause of severe gastroenteritis in young humans and animals. Primary infection is the most severe and reinfections usually produce only mild symptoms. Worldwide about 600 000 children die every year from rotavirus infection, and this figure represents about 5 % of all deaths in children younger than five years. Virtually all children will be infected by the time they reach one year of age. Because primary infection is so severe, rotavirus vaccines have been developed. Surveillance studies are needed to monitor the vaccine impact on circulating viral strains. It is important to know whether some strains disappear and new strains, possibly from animals, emerge. This rotavirus genotyping study is part of a long-term European surveillance study, which tries to define and monitor rotavirus types circulating in Europe. Proteins VP4, VP6 and VP7 are the primary antigens of rotaviruses. Rotavirus is classified into serogroups A-G based on inner layer protein VP6. Group A-C rotaviruses are human pathogenes. Most human rotavirus diseases are caused by group A rotavirus. The group A rotaviruses are further classified into G and P types based on the outer layer proteins VP4 and VP7. 15 G and 14 P types have been identified in humans. In this study we established G and P types for 200 rotavirus samples by using nested-PCR. Materials consisted of stool samples originated from HUSLAB virology department and Kuopio University Hospital. Rotavirus positive stool samples taken from children during years 2005-2007. RNA was extracted from stool suspensions and it was translated to DNA and amplified by nested-PCR. As first step RNA was transcripted to cDNA by reverse transcription. cDNA was amplified from gene segment areas that code for VP4 and VP7 proteins. As second step these PCR-products were amplified using G and P type-specific primers. Final PCR products were G and P typed by using agarose electrophoresis. We find that most common G types in 2005-2007 were G1 and G9; other G types was also found. Most common P type was P[8], which constituted 90 % of all viruses. The most common G and P combinations were G1P[8] and G9P[8]. In epidemic season 2006-2007 the most common G types in Helsinki were G1 and G9. In Kuopio predominant stains were G2 and G9. The most common G and P combinations in epidemic season 2006-2007 were G1P[8] and G9P[8] in Helsinki and G9P[8] and G2P[4] in Kuopio. In recent years the most common G types in Europe have been G1-G4 and G9. Finnish genotype distribution is mainly congruent with G and P types in other European countries.
-
(University of HelsinkiHelsingin yliopistoHelsingfors universitet, 2006)Clostridium botulinum on ehdottoman anaerobinen gram-positiivinen sauvabakteeri ja vaarallinen ruokamyrkytyspatogeeni. Sen tuottama hermomyrkky, botulinumtoksiini, aiheuttaa hengenvaarallista botulismia ihmisillä ja eläimillä. C. botulinum muodostaa itiöitä, jotka säilyvät äärimmäisissäkin ympäristöolosuhteissa. C. botulinum -kannat jaetaan metabolisten ominaisuuksiensa perusteella ryhmiin I-IV, joista ryhmät I ja II ovat ihmisille vaarallisia neurotoksiineja tuottavia. Ryhmän I kannat ovat proteolyyttisiä ja ryhmän II kannat ei-proteolyyttisiä. Bakteerin tuottaman toksiinin tyypin perusteella kannat jaetaan toksinotyyppeihin A-G, joista ryhmään I kuuluvat tyypit A, B ja F sekä ryhmään II tyypit B, E ja F. Koska samaa toksinotyyppiä olevia kantoja esiintyy sekä ryhmässä I että ryhmässä II, pelkän toksinotyypin perusteella kantojen erottelu ryhmiin ei ole mahdollista. Samaa toksinotyyppiä olevissa eri metabolisiin ryhmiin kuuluvissa kannoissa ainoa yhteinen tekijä on tuotetun toksiinin tyyppi. C. botulinum -kantojen tyypittämiseksi ryhmiin on tällä hetkellä käytössä erilaisia molekyylibiologisia menetelmiä, sekä perinteinen mikrobiologinen menetelmä jolla saadaan selville kannan proteolyyttisyys tutkimalla sen kykyä hajottaa kaseiinia. Molekyylibiologisista menetelmistä mainittakoon AFLP ja ribotyypitys. Menetelmien ongelmina ovat mm. niiden hitaus ja työläys sekä perinteisessä mikrobiologiassa epätarkka tulkinta. Tässä tutkimuksessa etsittiin ryhmien I ja II C. botulinum -kantoja erottelevat geenialueet DNAmikrosirutekniikan avulla. Ryhmien I ja II kaikista eri toksino-tyyppisistä (ryhmä I: A, B, F; ryhmä II: B, E, F) C. botulinum -kannoista eristetyt puhtaat DNA-näytteet leimattiin fluoresoivalla merkkiaineella ja hybridisoitiin C. botulinum ATCC 3502 DNA-mikrosirulle kilpailevaa hybridisaatiota käyttäen. Kontrollina käytettiin C. botulinum ATCC 3502 -kannan DNA:ta. DNA-mikrosirulla oli koettimina PCR-tuotteet ATCC 3502 -kannan kaikista geeneistä. Siten kaikkien näiden geenien läsnäoloa näytteessä pystyttiin tutkimaan yhdellä DNA-mikrosirukokeella. DNA:n hybridisaatioastetta koetinkohtaisesti tutkimalla etsittiin suurimman logaritmisen intensiteettieron ryhmien I ja II välillä antaneet geenialueet. Tunnistettujen alueiden perusteella suunniteltiin kuusi ryhmän I kannoille spesifistä alukeparia, joista kahden (CBO0250F/R ja CBO1073F/R) toimivuus testattiin 60 ryhmän I ja II eri toksinotyyppisellä C. botulinum -kannalla. PCR-menetelmä ryhmien I ja II erottamiseksi toisistaan optimoitiin käyttäen alukeparia CBO0250F/R, joka erotteli tarkasti kaikki 60 testattua C. botulinum -kantaa ryhmiin I ja II. Kehitetyllä PCR- menetelmällä voidaan erotella C. botulinum -kannat ryhmiin I ja II aikaisempiin molekyylibiologiin menetelmiin verrattuna huomattavasti nopeammin ja perinteisiin menetelmiin verrattuna luotettavammin. Menetelmä soveltuu rutiinikäyttöön C. botulinum -kantojen ryhmiin I ja II tyypittämiseen. Yksinkertaisten ja nopeiden tyypitysmenetelmien käyttö osana C. botulinumin diagnostiikkaa olisi tärkeää tautitapausten epidemiologisessa selvitystyössä, ja niitä tulisikin ottaa mahdollisimman paljon rutiinikäyttöön.
Now showing items 1-4 of 4