Browsing by Subject "neurotoksiinituotanto"

Clostridium botulinum on elintarvikevälitteinen patogeeni, joka tuottaa voimakkainta tunnettua myrkkyä botuliinitoksiinia. Botuliini on hermomyrkky, joka aiheuttaa botulismia sekä ihmisille että eläimille estämällä välittäjäaineen vapautumisen hermo-lihasliitoksessa. Hengityslihaksistoon edetessään botulismi on hoitamattomana mahdollisesti kuolemaan johtava sairaus. C. botulinum kannan ATCC 3502 botuliinitoksiinikompleksi koostuu toksiiniosasta (BoNT/A1), nonhemagglutiniiniosasta (NTNH) ja kolmesta hemagglutiniiniosasta (HA-17, HA-33 ja HA-70). Toksiinikompleksin osia koodaavat geenit sijaitsevat samassa lokuksessa ja muodostavat kaksi erillistä operonia. Operonien välissä sijaitsee geeni (botR), joka koodaa toksiinituotantoa säätelevää BotR-sigmatekijää. C. botulinum tuottaa itiöitä, jotka ovat ympäristössä hyvin kestäviä. Itiöitymisen pääsäätelijänä toimii Spo0A, joka aktivoituessaan aktivoi edelleen sigmatekijäkaskadin. Tässä säätelykaskadissa emosolun puolella itiöitymistä ohjaavia rakennegeenejä säätelevät SigE ja SigK, ja esi-itiön puolella SigF ja SigG. Tutkimus koostui kahdesta eri osasta. Tutkimuksen metodologisessa osassa I oli tarkoituksena arvioida pienistä bakteeripopulaatioista saatavaa RNA-määrää ja sen laatua. RNA:n tutkimusmenetelmiin vaaditaan tyypillisesti suuria määriä hyvälaatuista RNA:ta, ja menetelmästä riippuen tarvittava määrä vaihtelee 200 nanogrammasta 5:een mikrogrammaan. Tarkoituksena oli selvittää, kuinka paljon bakteerisoluja tarvitaan RNA-sekvensointiin ja RT-qPCR-menetelmään. Tutkimuksessa käytetyt bakteerisolupelletit säilytettiin -70°C:ssa ja niistä eristettiin RNA. Tutkimuksen biologisessa osassa II oli tarkoituksena vertailla kahden eri C. botulinum ATCC 3502 -kannan isolaatin transkriptioprofiilia toksiinituotantoon ja itiöitymiseen liittyvien geenien osalta. Isolaattien transkriptioprofiilin avulla saatiin tietoa siitä, mitkä geenit ilmentyvät solussa tietyllä ajanhetkellä. ATCC 3502 -kannan isolaatti tox+ tuottaa botuliinia, kun taas kannasta laboratorio-olosuhteissa spontaanisti mutatoitunut isolaatti tox- tuottaa botuliinia huomattavasti vähemmän. Neurotoksiinituotantokyvyn lisäksi myös isolaattien itiöitymiskyvyn tiedetään eroavan toisistaan. Tox--isolaatin itiöitymiskyky on aikaisempien tutkimusten perusteella heikentynyt. Tox+- ja tox--isolaattien aiempi genomianalyysi toi esiin tärkeitä eroavaisuuksia niiden genotyyppien ja fenotyyppien suhteen. Tox--isolaatin vaihtoehtoista sigmatekijää BotR koodaavasta geenistä (botR) löydettiin geenin lukukehyksen muuttava insertiomutaatio. Molemmat isolaatit (tox+ ja tox-) kasvatettiin identtisissä olosuhteissa (anaerobinen TPGY-liemikasvatusalusta, 37 °C), ja bakteereiden eri kasvuvaiheista eristettiin solunäytteet. Bakteerisoluista eristettiin RNA, jonka perusteella valmistettua cDNA:ta käytettiin templaattina kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa RT-qPCR-analyysissa. RT-qPCR-menetelmän avulla tutkittiin kohdegeenien (botA, ha33, spo0A, sigF, sigE ja sigG) ilmentymistä bakteerin eri kasvuvaiheissa. Referenssigeeninä käytettiin 16S rRNA:ta. Geenien esiintymiselle muodostettiin suhdeluvut, joiden perusteella isolaattien transkriptioprofiileja verrattiin toisiinsa. Tutkimuksen osion II tulokset osoittavat, että botuliinin rakennegeenien (botA ja ha33) ilmentyminen tox+-isolaatilla oli suurimmillaan 30–65-kertaisesti (p<0,05) suurempaa kuin tox--isolaatilla. Tuloksen avulla voidaan selittää aikaisemmissa tutkimuksissa havaittu ero isolaattien neurotoksiinituotannossa. spo0A-geenin ilmentyminen oli enimmillään noin 30-kertaisesti suurempaa tox+-isolaatilla kuin tox--isolaatilla, mutta ero ei ollut näin suuri eikä tilastollisesti merkitsevä solupopulaatioiden kaikissa kasvuvaiheissa. Itiöitymisen sigmatekijöitä koodaavien geenien (sigE, sigF ja sigG) kohdalla erot isolaattien välillä olivat suurempia kuin spo0A-geenin kohdalla. Geenien ilmentyminen oli yleisesti 20–30-kertainen tox+-isolaatilla tox--isolaattiin nähden. Saadun tuloksen avulla voidaan selittää isolaatin tox- heikentynyt kyky itiöityä. Toksiinituotannolla ja itiöitymisellä on siten todennäköisesti yhteisiä säätelymekanismeja ja/tai -signaaleja. Mutaatio BotR sigmatekijässä todennäköisesti vaikuttaa myös itiöitymisen säätelyyn. On todennäköistä, että C. botulinumin itiöitymisen säätelykaskadi osallistuu myös toksiinituotannon säätelyyn. Tutkimus antaa tärkeää lisätietoa C. botulinumin itiöitymisen ja toksiinituotannon säätelystä saman kannan eri tavoin käyttäytyvillä solupopulaatioilla. Tutkimuksen osiosta I saatujen tulosten perusteella bakteerisolujen ja niistä eristettävän RNA-määrän välille saatiin standardisuora. Saatua tietoa voidaan hyödyntää RNA-sekvensoinnin ja RT-qPCR:n tutkimuskäytössä. Saatujen tulosten avulla voidaan laskea halutun RNA-massan perusteella soluviljelmään tarvittava bakteerisolumäärä, tai vastaavasti kuinka suuri määrä RNA:ta on mahdollista saada tietyn kokoisesta bakteerisolupopulaatiosta. Tutkimuksen osiosta II saatujen tulosten perusteella C. botulinumin itiöitymisprosessi ja toksiinituotanto linkittyvät siis toisiinsa useaa eri reittiä pitkin, ja vaikuttavat näin toinen toisensa säätelyyn. Tärkeänä tekijänä niiden välillä useimmilla C. botulinum –kannoilla toimii vaihtoehtoinen sigmatekijä BotR, joka toksiinituotannon säätelyn lisäksi linkittyy myös itiöitymisprosessin säätelyyn mitä todennäköisimmin orpokinaasien välityksellä säätelemällä Spo0A:n fosforyloitumista.