Browsing by Subject "reaaliaikainen PCR"

Clostridium botulinum on anaerobisissa olosuhteissa kasvava grampositiivinen sauvabakteeri. Se tuottaa hermomyrkkyä, botulinumneurotoksiinia, joka voi aiheuttaa ihmisen tai eläimen elimistöön päästessään botulismi-nimisen sairauden. Botulismi voi johtaa hoitamattomana hengityslihasten halvaukseen ja kuolemaan. Bakteeri muodostaa epäsuotuisia olosuhteita kestäviä lepomuotoja, itiöitä, jotka voivat säilyä muun muassa elintarviketeollisuuden kuumennusprosesseissa ja kylmäsäilytyksessä. Säilytyksen aikana itiö voi muuttua takaisin lisääntymiskykyiseen muotoonsa ja alkaa tuottaa botulinumneurotoksiinia. C. botulinumin itiöitä esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, vesistöissä ja eläinten suolistoissa. Kuten moni muukin mikrobi, C. botulinumin itiöt voivat päätyä ympäristöstä elintarvikeketjuun. Kansainvälisiin tutkimuksiin perustuen itiöiden esiintyvyys valmisruokien liharaaka-aineissa on 0–10 %. Itiöitä on näytteissä ollut 2–4 itiötä/kg. Suomessa liharaaka-aineita ei ole tutkittu, mutta kalassa ja hunajassaitiöiden esiintyvyydet ovat olleet 5–40 %. Liharaaka-aineiden itiökontaminaation selvittäminen on tärkeää, jotta voidaan arvioida itiöiden valmisruokateollisuudelle asettamat riskit ja tarvittaessa optimoida valmisruokateollisuuden käytössä olevia valmistusprosesseja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, esiintyykö suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa C. botulinumin itiöitä. Tutkimuksessa käytettiin CEN ISO/TS 17919:2013 - standardimenetelmää, joka perustuu botulinumneurotoksiinigeenien (tyypit A, B, E ja F) osoittamiseen näytemateriaalista eristetystä bakteeri-DNA:sta reaaliaikaisella PCR-tekniikalla. Tutkimuksessa tutkittiin yhteensä 87 broilerin- ja sianlihanäytettä. Kansainvälisiin tutkimuksiin ja suomalaisiin kala- ja hunajatutkimuksiin perustuen hypoteesiksi asetettiin se, että myös suomalaisissaelintarvikeraakaaineissa voisi olla itiöitä eli yksi tai useampi tutkittava näyte noin 90 tutkittavasta näytteestä olisi botulinumneurotoksiinigeenin suhteen positiivinen. Kaikki tutkitut näytteet olivat botulinumneurotoksiinigeenin suhteen negatiivisia. Kontrollinäytteet antoivat positiivisen tuloksen, kun näytteisiin lisätyt itiömäärät olivat 3 itiötä/kg tai enemmän. Näytteissä oli näin ollen vähemmän kuin 3 itiötä/kg. Tutkimusten mukaan elintarvikkeet kontaminoituvat itiöillä jonkin verran, mutta tämän työn perusteella suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa näyttää esiintyvän vain vähän tai ei ollenkaan C. botulinumin itiöitä. Suuremman näytemäärän tutkiminen vahvistaisi negatiivisen tuloksen luotettavuutta ja auttaa arvioimaan lihapohjaisiin valmisruokiin liittyvää C. botulinum -riskiä.

PCR-pohjaisissa viljelystä riippumattomissa menetelmissä geenin monistumistehokkuuden eroavuudet voivat aiheuttaa epätarkkuutta mikrobiyhteisöstä saatuun kuvaan. Tässä tutkimuksessa arvioitiin 16S rRNA -geeniin sitoutuvan universaalin alukeparin soveltumista lihan pilaantumisen kannalta merkittävien maitohappobakteerien tutkimiseen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä. Työssä tutkittiin yhteensä 36 maitohappobakteerien tyyppi- ja referenssikantaa Carnobacterium-, Enterococcus-, Lactobacillus-, Lactococcus-, Leuconostoc- ja Weissella-suvuista. Maitohappobakteerien lisäksi tutkittiin Brochothrix thermospacta -lajin tyyppi- ja referenssikantaa. Bakteerikannat kasvatettiin MRS- tai TS-elatusaineilla anaerobisissa olosuhteissa. DNA:n eristykseen käytettiin muokattua Pitcherin menetelmää. Templaatti-DNA:n laatu ja konsentraatio määritettiin spektrofotometrisesti. PCR-monistus tehtiin reaaliaikaisella kapillaarilaitteella (LightCycler®) SYBR Green –kemiaa käyttäen, jolloin PCR-tuotteen muodostumista voitiin seurata ajon aikana. Monistuksessa käytettiin HDA1/HDA2 –alukeparia, jossa HDA1-alukkeeseen oli kiinnitetty GC-häntä. Kunkin ajon jälkeen LightCycler™ ohjelmisto ilmoitti kullekin reaktiolle kynnysarvon (Cp, crossing point). Lisäksi ajo-ohjelma suoritti sulamiskäyräanalyysin kullekin tuotteelle. Lopuksi PCR-tuotteet ajettiin vielä etidiumbromidilla värjätyssä agaroosigeelissä. Templaatit monistuivat käytetyillä alukkeilla hyvin ja agaroosigeelielektroforeesin perusteella kustakin kannasta saatiin odotetun kokoinen PCR-tuote. Kynnysarvot vaihtelivat eri lajeilla 9,9:stä 18,5:een. Myös saman lajin eri kantojen kynnysarvot poikkesivat toisistaan, mutta erot eivät olleet aivan yhtä suuria kuin tarkasteltaessa kaikilta lajeilta saatuja arvoja. Brochothrix thermospacta -kannat ja Weissella-suvun kannat monistuivat tehokkaimmin, Carnobacterium- ja Enterococcus-sukujen kannat heikoimmin. Kuten oli odotettavissa, GC-hännällisistä tuotteista muodostui kaksi sulamispistettä. Alempi sulamispiste havaittiin lämpötila-alueella 80,5-84,2 °C ja ylempi lämpötila-alueella 83,7-90,7 °C. Lactobacillus-suvussa alempien sulamispisteiden lajien väliset vaihtelut olivat suurimmat, Weissella- ja Enterococcus-suvuissa pienimmät. Tutkitulla alukeparilla maitohappobakteerien monistumisen kynnysarvot poikkesivat viitaten amplifikaatiotehokkuuksien eroihin. Tästä johtuen populaatiota kuvaavaan sormenjälkeen saattaa muodostua epätarkkuuksia, mitä tullaan jatkossa tutkimaan DGGE-menetelmällä.