Browsing by department "Elintarvike- ja ympäristöhygienian laitos"

Cryptosporidium on ympäristössä laajalle levinnyt, alkueläimiin kuuluva parasiitti. Organismi eristettiin ensimmäisen kerran vuosisadan alussa, mutta vasta muutamien vuosikymmenten ajan sen aiheuttama uhka sekä eläinten että ihmisten terveydelle on ymmärretty. Cryptosporidium on yksi Protozoa-pääjakson edustaja. Alajaksoista se kuuluu Sporozoiin, joten se liikkuu lähinnä lipumalla, ja elinkierto tapahtuu vakuoleissa suoliston epiteelin pinnallisimmassa kerroksessa. Lisääntyminen on sekä suvullista että suvutonta. Sporozoa-alajakso jakaantuu edelleen kolmeen luokkaan, joista Coccidia-luokka käsittää epiteelisolujen parasiitteja. Cryptosporidium-suku kuuluu tähän ryhmään. Suvun sisäisessä taksonomiassa esiintyy toistaiseksi vielä hurjasti epäselvyyksiä, sillä tämänhetkiset spesifikaatiokriteerit ovat riittämättömät vahvistamaan perinteisesti nimetyt lajit, ja geneettinen tietomäärä on tällä hetkellä vielä rajallista. Yleisesti on kuitenkin tunnettua, että lajeista Cryptosporidium parvum on ollut vastuussa lukuisista sekä kotieläinten että ihmisten kliinisistä sairaustapauksista. Erilaiset endoparasitaarisesti elävät prototsoat käyvät läpi myös elinvaiheen isännän ulkopuolella, ja koska nämä muodot pystyvät usein pitkiäkin aikoja selviämään ulkomaailmassa varsin epäsuotuisissakin olosuhteissa kuvataan niitä termillä kestomuoto. Näihin kestomuotoihin kuuluvat myös infektiiviset Cryptosporidium-ookystat, jotka resistenttisyytensä vuoksi aiheuttavat potentiaalisen sekä ympäristön kontaminaatiouhan että ongelman vedenkäsittelylaitoksille. Ihmisille tärkeimmät ookystalähteet lienevät infektoituneet kanssaihmiset, mutta myös lemmikki- ja hyötyeläimiä sekä laboratorioeläimiä on pidettävä mahdollisina ihmisten terveyttä uhkaavina tekijöinä. Ympäristöistä erityisesti ookystilla saastunut vesi on sisällytettävä potentiaalisten infektiolähteiden listaan. Mahdollisina tartuntalähteinä pidetään myös fomiitteja. Cryptosporidium parvumin roolia elintarvikeperäisenä patogeenina ei ole selvitetty riittävästi, mutta parasiitin epidemiologiset piirteet antavat aihetta olettaa kontaminoitujen elintarvikkeiden aiheuttamien kryptosporidioositapausten insidenssin olevan aliarvioidun. Tiedot kryptosporidioosista liittyvät voimakkaasti taloudellisesti merkittäviin tuotantoeläimiin. Kliinisistä infektioista kärsivät pääosin vastasyntyneet. Cryptosporidium parvum kykenee kuitenkin aiheuttamaan jopa henkeäuhkaavan, persistoivan, koleratyyppiseksikin luokitellun ripulin immuunijärjestelmän puutoksista kärsiville ihmisille. Toisaalta myös normaalit, aiemmin terveet henkilöt voivat sairastua. Organismin on todettu aiheuttavan sekä suuria taudinpurkauksia että sporadisia tapauksia ja turistiripulia. Kehitysmaissa sitä pidetään, jopa yhteisötasollakin, johtavana pitkittyneen ripulin aiheuttajana. Alkueläimet eivät lisäänny elimistön ulkopuolella, joten niiden osoittamisessa ollaan pitkälti turvauduttu suoriin menetelmiin. Vuosia organismin diagnosointi on perustunut ookystien osoittamiseen erilaisia värjäysmenetelmiä ja mikroskooppista tutkimusta hyväksikäyttäen. Muita menetelmiä ovat lähinnä immunodiagnostiset tekniikat. Molekyylibiologia on valtaamassa alaa myös parasiitteja tutkivissa laboratorioissa, ja jatkuvasti kehitelläänkin uusia nukleiinihapon detektointiin perustuvia, lähinnä polymeraasiketjureaktioon pohjautuvia menetelmiä myös Cryptosporidiumin diagnostiikassa. Työn tutkimusosassa perehdyttiin erilaisiin Cryptosporidium parvumin osoitusmenetelmiin. Sekä happovärjäysmenetelmä, immunofluoresenssiin perustuva tekniikka, IMS-esikäsittely ja PCR-menetelmä osoittautuivat kaikki melko työläiksi ja vaativiksi. Yhteenvetona voidaan todeta, että diagnostiikka ei ole ongelmatonta, ja uusien, kustannustehokkaiden, luotettavien ja yksinkertaisten menetelmien kehittely sekä saattaminen rutiinilaboratoriotutkimusten apuvälineiksi on toivottavaa.

Vuonna 1995 kehitettiin DNA-mikrosiruihin perustuva menetelmä tutkia yhtäaikaisesti tuhansia geenejä. Menetelmää on siitä lähtien sovellettu monilla tieteenaloilla mm. syöpätutkimuksessa, lääkkeiden kehittämisessä ja genomiikan tutkimuksessa. Viimeisen kymmenen vuoden aikana on ilmestynyt lukuisia julkaisuja, jotka käsittelevät DNA-mikrosirutekniikan sovelluksia eri biotieteen aloihin. Tässä työssä luodaan yleiskatsaus DNA-mikrosirutekniikan perusperiaatteisiin sekä esitellään sen käyttöä elintarvikepatogeenien tutkimuksessa. Elintarvikepatogeenitutkimuksissa DNA-mikrosirutekniikkaa on käytetty lähinnä viiteen tarkoitukseen: diagnostiikkaan, genotyypitykseen, evolutiivisen genomiikan tutkimuksiin, geeniekspressiotutkimuksiin ja isäntä-patogeeni-vuorovaikutuksen tutkimiseen. DNA-mikrosirutekniikalla on nykyään useita variaatioita, mutta periaate on kaikissa sama: lastumaiselle tukimateriaalille, esimerkiksi mikroskooppilasille, on erittäin tiheään asetettu tutkittavia geenejä edustavat koettimet. Näytteen DNA-juosteet kiinnittyvät emäspariperiaatteen mukaisesti (A-T ja G-C) kukin omalle koettimelleen. Tämän pariutumistapahtuman tuloksia luetaan mikrosirulta ja analysoidaan. Näyte-DNA saadaan eristämällä tutkimuskohteesta DNA:ta tai RNA:ta, joka käännetään käänteistranskriptiolla komplementaariseksi DNA:ksi. DNA-mikrosirukokeeseen liittyy monia eri vaiheita: 1. Mikrosirun valmistus 2. Näytteen valmistus ja leimaus 3. Hybridisaatio 4. Tulosten lukeminen mikrosirulta 5. Tulosten käsittely ja analyysi 6. Koetulosten tulkinta DNA-mikrosirutekniikan suurimmat edut ovat sen tarkkuus ja nopeus. Geenit pystytään tunnistamaan ja erottamaan toisistaan tarkasti niiden spesifisen emäsjärjestyksen perusteella ja yhdellä kokeella saadaan tietoa koko genomista. Tekniikan ongelmat liittyvät toisaalta juuri valtavaan tietomäärään, jota on vaikea käsitellä ja tulkita sekä kokeen monivaiheisuuteen, mikä lisää virhemahdollisuutta. Lisäksi menetelmä on monilta osin vielä hyvin kallis.

Elintarvikkeiden pakkaaminen kertakäyttöpakkauksiin on aiheuttanut yhä laajamittaisemman ympäristöongelman. Perinteisesti pakkausjätteet ovat joutuneet kaatopaikoille tai jätteenpolttolaitoksille, mutta yhä etenevässä määrin elintarvikepakkauksia on pyritty keräämään hyötykäyttöön. Tässä kirjallisuuskatsauksessa olen tarkastellut eläinperäisten elintarvikepakkausten kierrätystä ja hyötykäyttöä. Olen tarkastellut ongelmaa sekä EU:n että Suomen näkökulmasta. Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 94/62/EY vuodelta 1994 velvoittaa tehostamaan nimenomaan pakkausjätteiden kierrätystä. Valtioneuvoston päätös vuodelta 1997 antaa ohjeet ja velvoitteet Suomen osalle. Suomessa ollaan tiettyjen kierrätysmenetelmien kohdalla aivan Euroopan kärkimaita. Pakkausjätteiden hyödyntäminen on ainoa järkevä ja kestävä vaihtoehto, koska se vähentää ympäristöhaittoja ja pakkausjätteiden määrää.

Listeria monocytogenes on grampositiivinen sauvabakteeri, jota löytyy yleisesti maaperästä. L. monocytogeneksen aiheuttamaa sairautta, listerioosia, tavataan vastasyntyneillä, vanhuksilla, raskaana olevilla ja immuniteetiltaan heikentyneillä ihmisillä. Ihmisten listerioosi on elintarvikeperäinen sairaus ja L. monocytogenesta onkin eristetty useista erilaisista elintarvikkeista. Listerioosin esiintyminen on lisääntynyt viimeisten vuosikymmenien aikana. Syynä pidetään muutoksia elintarvikkeiden tuotannossa ja säilyttämisessä, immuniteetiltaan heikentyneiden ihmisten määrän lisääntymistä sekä väestön ikääntymistä. L. monocytogenes on solunsisäinen bakteeri, jonka patogeneesista voidaan erotella neljä vaihetta: 1) internalisaatio, 2) pakeneminen fagosomista tai solunsisäisestä vakuolista, 3) lisääntyminen ja liikkuminen solun sisällä sekä 4) leviäminen solusta toiseen. Patogeneesiin osallistuvia virulenssigeenejä tunnetaan useita. Näitä ovat mm. prfA, plcA, hly, mpl, actA, plcB, inlA, inlB ja iap. Eri L. monocytogenes -kannat vaikuttavat sopeutuneen elämään erilaisissa ekologisissa lokeroissa. Tämän perusteella on oletettavissa, että niiden virulenssisakin olisi eroja. Tällä hetkellä ei kuitenkaan tunneta kyseisiä eroja, joten kaikkia L. monocytogenes -kantoja pidetään potentiaalisesti patogeenisina. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko virulenssigeenien esiintymisessä eroja eri alkuperää olevien L. monocytogenes -kantojen välillä ja voidaanko näiden erojen perusteella päätellä kannan alkuperä. Tutkimusmenetelmänä oli multiplex-PCR, jossa kahden eri reaktion avulla tutkittiin prfA-, plcA-, hly-, mpl-, actA-, plcB-, iap-, inlA-, inlB-, inlC-, inlD-, inlF- ja inlE-geenien esiintymistä. Tutkittavia kantoja oli 484 ja ne olivat peräisin säilörehusta (54 kpl), elintarvikelaitoksista (126 kpl) ja niiden laitteista (81 kpl), elintarvikkeista (183 kpl) ja raaka-aineista (40 kpl). Kaikilta tutkituilta L. monocytogenes -kannoilta löytyi 88-92 % virulenssigeeneistä. Eri alkuperää olevien kantojen välillä ei ollut merkittäviä eroja. Yksittäisten geenien esiintymisessä eri paikoista peräisin olevien kantojen kesken havaittiin huomattaviakin eroavaisuuksia. Yleisin geeni oli hly, joka löytyi kaikilta tutkituilta L. monocytogenes –kannoilta. Muiden geenien yleisyysjärjestys oli seuraavanlainen: plcB > inlE > iap > mpl > inlA > inlF > prfA > actA > inlC > inlD > plcA. Geenien esiintymisessä havaittujen erojen perusteella ei kuitenkaan ollut mahdollista päätellä eri kantojen alkuperää. Tutkimuksemme perusteella vaikuttaisi siltä, että kaikilta kannoilta ei löydy kaikkia virulenssigeenejä.

Escherichia coli O157:H7 on yksi enterohemorraagisiin E. coli -kantoihin kuuluvista serotyypeistä. EHEC-kannat voivat aiheuttaa vakavan jopa kuolemaanjohtavan infektion ihmisillä, eritoten lapsilla. EHEC:n pääreservoaari on nauta ja merkittävin EHEC-tartunnan lähde on raaka tai riittämättömästi kypsennetty naudanliha, joka on teurastuksen yhteydessä kontaminoitunut EHEC-bakteereita sisältävällä ulosteella. Kestomakkara valmistetaan ilman kuumennuskäsittelyä fermentoimalla maitohappobakteereilla jauhettua naudan- ja sianlihaa. Muista elintarvikepatogeeneista poiketen EHEC on ainutlaatuisen kestävä happamille olosuhteille, mikä mahdollistaa EHEC:n selviytymisen kestomakkaran valmistusprosessissa. EHEC:n pienestä infektiivisestä annoksesta johtuen muodostavat kestomakkarat riskielintarvikkeen, sillä EHEC voi säilyä niissä kauan tartuntakykyisenä pitkästä kylmäsäilytyksestä huolimatta. Probiootilla tarkoitetaan ravintoon lisättyä elävää mikrobipreparaattia, jolla on suotuisa vaikutus ihmisen terveyteen tiettynä pitoisuutena. Probioottiset maitohappobakteerit voivat tuottaa myös erilaisia antimikrobisia yhdisteitä. Ne voivat tarjota yhden lisäesteen EHEC:n selviämiselle kestomakkaran fermentoinnissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia kolmen probioottisen Lactobacillus rhamnosus -kannan (L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LC-705 ja L. rhamnosus E-800) vaikutusta Escherichia coli O157:H7 -bakteerien selviytymiseen kestomakkaran fermentoinnissa ja jälkikypsytyksessä verrattuna kaupalliseen Pediococcus pentosaceus -kantaan. Tutkimus todisti olevan mahdollista käyttää probioottisia kantoja kestomakkaran fermentoinnissa. Escherichia coli O157:H7 -pitoisuus laski kestomakkaran fermentoinnin ja jälkikypsytyksen aikana (28 vrk) pitoisuudesta 4.5 log pmy/g pitoisuuteen 1.5 log pmy/g. Kuitenkaan probioottisten L. rhamnosus -kantojen ja kaupallisen kannan vaikutuksissa Escherichia coli O157:H7-bakteerien selviytymiseen ei havaittu eroa.

Clostridium botulinum är en anaerob, sporbildande bakterie som under tillväxten producerar botulinum-neurotoxin, som är en av världens mest giftiga föreningar. Sporer av C. botulinum förekommer allmänt i omgivningen, och kan även förekomma som kontaminanter i livsmedel eller djurfoder. Då förhållandena är gynnsamma för deras tillväxt kan de producera toxin och förorsaka botulism hos människor och djur. Botulism hos nötkreatur är en relativt sällsynt sjukdom, men då den förekommer kan den förorsaka stora ekonomiska förluster eftersom ofta flera djur i samma besättning drabbas. Smittokällan har ofta varit foder som kontaminerats med döda djur eller ensilage vars tillverkningsprocess misslyckats beträffande pH eller fukthalt. Få undersökningar har gjorts beträffande förekomsten av C. botulinum-sporer i husdjurens avföring. Hos friska nötkreatur har förekomsten i gjorda undersökningar varit ringa, men undersökningar i samband med kliniska botulismfall har visat att nötkreatur kan fungera som bärare av sporer efter det att symptomen i de drabbade besättningarna avklingat. Målet med detta projekt var att utreda huruvida C. botulinum av serotyperna A, B, E och F förekommer i tarmens normalflora hos nötkreatur i Finland under vinterperioden. Dessutom ville man utreda inverkan av miljöfaktorer och utfodring på prevalensen av C. botulinum, samt även kvantiteten av C. botulinum-sporer i proverna. Arbetet gjordes som en del i en undersökning som utreder hur honung kontamineras med bakterien. Bisamhällens vattenanskaffning sker ofta från gödselhögar eller -brunnar, och man ville utreda om husdjursgödsel kunde vara en möjlig kontaminationsrutt till honungen. Sammanlagt undersöktes avföringsprover från 99 djur från 20 olika orter i Finland. Proverna analyserades med hjälp av multiplex-PCR. Ingen förekomst av C. botulinum-sporer konstaterades i avföringen hos de undersökta nötkreaturen. På basen av denna undersökning är det därmed osannolikt att C. botulinum skulle förekomma i tarmens normalflora hos nötkreatur. Eftersom inga positiva prover påträffades kunde man inte heller dra några slutsatser om inverkan av miljöfaktorer och utfodring på förekomsten av C. botulinum-sporer i avföringen. Kvantiteten av dessa i proverna kunde ej heller bedömas med den använda metoden.

Giardia on suoliston parasiittina elävä alkueläin, jota tavataan ihmisillä ja useilla muilla nisäkkäillä sekä sammakkoeläimillä, matelijoilla ja linnuilla. Nisäkkäillä esiintyvää G. intestinalis –lajia on tavattu ihmisen lisäksi mm. koiralla, kissalla, märehtijöillä, hevosella, rotalla ja majavalla. Tartunta tapahtuu feko-oraalisesti ulostesaastuneen juomaveden tai ruoan välityksellä tai kosketustartuntana eläimestä/ihmisestä toiseen. Koirilla infektio on usein oireeton, mutta se voi myös aiheuttaa voimakkuudeltaan vaihtelevaa ripulia. Muita mahdollisia oireita ovat laihtuminen, kasvun hidastuminen ja heikentynyt ruokahalu. Aikaisemmissa tutkimuksissa giardian prevalenssiksi koirilla on saatu 4-50 %. Suomessa prevalenssitutkimuksia ei ole aikaisemmin tehty koirilla. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään giardian esiintyvyyttä suomalaisilla koirilla immunofluoresenssimikroskooppitutkimuksen avulla. Ulostenäytteitä kerättiin 146 koiralta. Näistä alle 6 kk ikäisiä pentuja oli 26 kpl. 10 koirista oli Yliopistolliseen eläinsairaalaan tuotuja löytökoiria. Muut olivat yksityisten ihmisten lemmikkejä. Kultakin koiralta pyrittiin saamaan kaksi ulostenäytettä 5-7 vrk välein. Giardia-positiivisten koirien osuus tässä aineistossa oli 4,8 %. Alle 6 kk ikäisillä koirilla giardia-positiivisten koirien osuus oli 15,4 % ja yli 6 kk ikäisillä koirilla 2,5 %.

Helicobacter pullorum was originally isolated from chickens at the beginning of the 90s. The bacterium has also been isolated worldwide from patients suffering from symptoms of the intestinal tract and it is suspected to be zoonotic. H. pullorum may infect chickens at the time of slaughtering, and hence it may create a risk for alimentary hygiene. Altogether over twenty helicobacteria are known, and they have been found in the gastrointestinal tract of various mammals and chicken. The importance of some species, such as Helicobacter pylori, as human pathogens has been proved. The clinical part of this study was conducted in spring 1999, at which point there was relatively little information and research done on H. pullorum. This study compares the applicability of different culture media as well as the filter method in isolating H. pullorum, and detects the occurrence of the bacterium in poultry samples. There were no notable differences in the applicability of studied culture media for the cultivation of H. pullorum, whereas the filter method could not be considered reliable. The poultry samples consisted of liver samples and the content of the caecum of egg-laying hens. The samples collected at a slaughterhouse provided 22 bacterial strains that can be identified as either Campylo- or Helicobacteria on the basis of their phenotypic features. With current knowledge these strains could be identified more specifically, using for instance PCR method. Notwithstanding the Helicobacter pylori bacterium, the isolation of Helicobacteria especially by cultivation methods has been shown to be demanding due to their specific growth/colonization factors. This is why Helicobacteria may have a greater influence both in veterinary and human medicine than is known so far. However, to estimate the pathogeneticity and zoonotic nature of Helicobacter pullorum requires further research.

The objective of the Finnish Hygiene Act (The Act on Food Hygiene of Foodstuffs of Animal Origin 1195/1996) is to ensure the hygienic quality of foodstuffs of animal origin and prevent the spread of infections from animals to humans via foodstuffs. The Act applies to the handling of foodstuffs of animal origin, hygienic quality requirements, control and inspections prior to retail. It also applies in first destinations to the control and inspections of foodstuffs of animal origin imported to Finland from another member state of the European Union. EU approved establishment, i.e. plant according to the Hygiene Act, is a facility or building where foodstuffs of animal origin are manufactured, stored or handled. The Hygiene Act obliges the plants to draw up and implement an own-check system to help make sure that any shortcomings in terms of the food hygiene are prevented. The own-check system consists of an own-check plan and implementation of the plan. The own-check plan is composed of written own-check programmes and working instructions covering all premises and functions of the plant. The implementation of the own-check plan includes bookkeeping of the implementation. The plant has to make sure that the own-check system is up to date, in accordance with legislation and functional. According to the Hygiene Act, the approval of the plants and their own-check systems as well as management of the control and inspections is assigned to the municipal control authorities with the exception of slaughterhouses and adjacent plants. According to the National Food Agency's instructions municipalities send the control results of each plant on a specific assessment form to the State Provincial Offices at least once a year. In this study the control results of the plants and their own-check systems were analysed. Municipal officials had assessed the level of own-check in EU-approved establishments other than slaughterhouses to be between good and fair in 2002. Assessments had been made in 366 plants (29 %) out of 1267. Assessments from the province of Åland were not included in this study. There were significant differences in the assessments between provincial districts and between certain types of establishments. The differences between districts indicate that the official control of the plants may not have been acceptably uniform thoughout Finland. Own-check had been assessed to be significantly better in dairy plants than in plants handling meat or fish products. In addition, results of this study indicate that EU approved establishments follow their own-check plans, for there were no significant differences in the assessments between the own-check programmes and the corresponding implementations.

In humans influenza viruses cause infectious respiratory disease, which can in worst case be lethal. Particularly virulent are those influenza A virus strains against which the patient has no previous immunity. It is known that birds serve as reservoir for all influenza viruses. Approximately ten years ago it was found that bird influenza A virus (H5N1) can be transmitted from birds to man causing serious infection. Very little is known about the significance of water in spread of influenza viruses. However it is known that influenza A viruses in birds multiply in the gut. Particularly duck-type of birds excrete large amounts of viruses to lakes and oceans in their feces. It has been shown that influenza viruses could stay infectious as long as 30 days if the water is salt free, moderately alkaline and cool. It is presumed that influenza viruses can survive over the winter buried in ice and be still infectious when the ice melts in spring. The goal of this study was to develop a filtrating method that could be used to detect influenza A viruses from water samples. Three commercial filters, Zetapor, Millipore (SMWP) and Sartorius (D5F), were compared. The concentration of viruses is based on electric interaction between the filters and the viruses. An additional goal was to figure out if the results of the filtration could be improved by dipping the filter to chickens, pigs or cows serum before the filtration. These sera differ from each other in carbohydrate chain sialic acid bonding. In this study human influenza A virus strain (H3N2) and bird influenza A virus strain (H5N2) were used. The desired amount of the virus was added to distilled water and the specimen was poured into the filtrating system that worked on negative pressure. To test the receptor specificity Millipore filters were incubated in inactivated chicken, pig or cow serum before filtration. The viruses were eluted from the filter membrane using a lysis buffer from RNA purification kit (QIAamp viral mini RNA kit). In the buffer the genome of the virus was released from its structural components. RNA was purified using the same kit and detected by real-time RT-PCR. In this study Millipore filter was the most efficient in filtrating influenza viruses. Virus recovery using this filter varied between 62,1% and 65,9%. It was 2,5 to 21,2 times more efficient than the other two filters. The second best filter was Zetapor (9,5-24,7%), although the difference between Zetapor and Sartorius (3,1-18,6%) was minimal. Dipping the filter into the sera showed no difference to the results compared to filters without serum. Millipore nitrocellulose filter would be a good choice for filtrating lake and sea waters because of its large pore size. Because the amounts of the viruses in natural waters are most likely very small, each step in the method should be optimized to further increase the sensitivity of the filtration method.