Browsing by discipline "Biokemi"

Alzheimerin tauti (AT) on yleisin dementian syy ja perintötekijöiden vaikutus tautiriskiin on suuri. APOE-geenialue on vahvimmin AT:iin liittyvä geenialue. APOE:sta on kolme yleistä alleelia, joiden koodamassa proteiinissa on 1-2 aminohapon eroja: E2, E3 ja E4, joista APOE4 on voimakas AT-riskitekijä. Suomalaistutkimuksissa on osoitettu, että eräs yleinen APOE3-haplotyyppi lisää ja toinen APOE3-haplotyyppi pienentää AT-riskiä. Etiologinen variantti APOE3-haplotyypissä on tuntematon. Tässä tutkimuksessa selvitettiin kolmen pistepolymorfismin avulla APOE:n viereisen TOMM40-geenialueen vaikutusta tautiriskiin, erityisesti APOE3-haplotyypin osana. Aikaisemmin kerätystä vantaalaisesta ikäkohortista monistettiin tutkittavat alueet polymeraasiketjureaktiolla (PCR), käsiteltiin PCR-tuotteet restriktioenstyymeillä ja tutkittiin restriktiotuotteet geelielektroforeesilla. Saatuja tuloksia vertailtiin aikaisemmin aineistosta kerättyyn kliiniseen, neuropatologiseen ja geneettiseen tutkimustietoon. Tulokset osoittivat TOMM40-geenialueen olevan kytkentäepätasapainossa APOEpromoottorialueeseen, mutta ei APOE-proteiinia määrittävään eksoni-4:ään. TOMM40-polymorfismien avulla voitiin erottaa myös APOE-tyypistä riippumaton heikko AT-riskivaikutus. TOMM40- ja APOE-polymorfismien analyysi viittasi siihen, että primaari geneettinen riskitekijä APOE3-haplotyypeissä on APOE-geenin ei-koodavalla alueella, mahdollisesti promoottori/enhancer-alueella. Jatkotutkimuksissa selvitetään, vaikuttaako tämä riskitekjä APOE:n, TOMM40:n tai muiden lähigeenien ekspressioon.

Nykyiset DNA:n eristämiseen ja puhdistamiseen käytetyt myrkyttömät proteiinien ulossuolausmenetelmät (protein-salting-out) ovat vielä melko aikaavieviä ja eräissä tilanteissa jopa epäluotettavia. Tämän työn tarkoituksena on kehittää luotettava ja entisiä menetelmiä nopeampi proteiinien ulossuolausmenetelmä kromosomaalisen DNA:n eristämiseksi viljellyistä ihmisen soluista (Jurkat, K562 ja U937). Tämän uuden proteiinien ulossuolausmenetelmän avulla voidaan 60 minuutissa eristää puhdasta ja suurimolekyylimassaista DNA:ta erilaisiin vaativiin sovelluksiin, kuten genomisten DNA kirjastojen valmistukseen ja niiden analyysiin. Tässä työssä kehitetty DNA:n eristysmenetelmä validoitiin tekemällä puhdistetusta DNA:sta geenikirjasto, josta vektoretti-PCR:ään perustuvalla kromosomikävelyllä eristettiin ihmisen kasvurajoitegeenin, tp53-geenin, promoottorialue, joka analysoitiin restriktioentsyymikartoituksella ja sekvennoinilla.

Kilpailusuorituksessa vinttikoirille kertyy runsaasti maitohappoa lihaksiin, mikä vaikeuttaa lihasten supistumista ja siten alentaa koiran suorituskykyä. Maitohappo on kuitenkin myös tärkeä energianlähde rasituksen (oksidatiiviset lihassolut) ja palautumisvaiheen aikana (oksidatiiviset- ja glykolyyttiset lihassolut). Fysiologisessa pH:ssa maitohappo on 99 %:sti dissosioituneena laktaattianioniksi ja protoniksi. Koska vain dissosioitumaton maitohappo voi diffundoitua ulos lihassolusta, tarvitaan erityinen kuljettajamekanismi siirtämään maitohappoa lihassolun solukalvon lävitse. Nisäkkäillä on löydetty kaksi eri maitohapon kuljettajaproteiinia: MCT (monokarboksylaattikuljettaja) ja Band-3 (anioninvaihtajamekanismi). Ihmisellä kuljettajaproteiinit vastaavat 50-90 %: sti laktaatin kuljetuksesta lihassoluissa. Punasoluissa MCT:n osuus laktaatin kuljetuksesta on > 90 %. Monokarboksylaattikuljettajia on löydetty tähän mennessä yhdeksän kappaletta, jotka on nimetty löytämisjärjestyksessä (MCT1- MCT9). Monokarboksylaattikuljettajilla on kudos- ja eläinlajispesifisiä ominaisuuksia. Punasoluissa monokarboksylaattikuljettajana ihmisellä, hamsterilla, sialla, naudalla ja porolla toimii MCT1, hevosella MCT2. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli karakterisoida koirien punasolujen monokarboksylaattikuljettaja ja selvittää vaikuttaako harjoittelu vinttikoirien punasolujen MCT:n aktiivisuuteen. Lisäksi mitattiin rasituksen jälkeen laktaatin jakautumista veressä plasman ja punasolujen välillä. Tutkimuksessa oli mukana kahdeksan vinttikoiraa, viisi borzoita ja kolme whippettiä. Koirien MCT:n todettiin immunologisesti olevan MCT1. Western blottingissa MCT1 proteiini oli jakautunut kolmeen fraktioon, joiden molekyylipainot olivat n. 100 kDa, n. 70 kDa ja n. 45 kDa. Pienin fraktio oli molekyylipainoltaan kirjallisuudessa raportoidun MCT:n suuruinen, 70 kDa fraktio oli mahdollisesti dimeeri ja suurin fraktio oli kooltaan samansuuruinen kuin kirjallisuudessa kuvattu MCT-chaperonikompleksi. Koirien lepo- ja kilpailukauden verinäytteistä tutkittiin laktaatin kuljetusaktiivisuus punasoluihin radioaktiivisen laktaatin avulla. Harjoituskauden jälkeen laktaatin kokonaiskuljetusaktiivisuus ja MCT:n aktiivisuus olivat merkitsevästi alentuneet (p < 0,01). Diffuusion ja anioninvaihtajamekanismin osuuksissa ei todettu merkitseviä muutoksia. Rasituksen jälkeisissä verinäytteissä laktaatista oli punasoluissa keskimäärin n. 46 %, plasman sisältämän laktaatin ja solujen sisältämän laktaatin suhteen ollessa 0,93. Veren ja plasman laktaattipitoisuuksien välillä todettiin olevan positiivinen korrelaatio samoin kuin myös veren laktaattipitoisuuden ja vinttikoirien juokseman matkan välillä. Koska tässä tutkimuksessa saadut tulokset harjoittelun vaikutuksesta punasolujen laktaatin kuljetusaktiivisuuteen poikkeavat aikaisemmin rekikoirilla suoritetun tutkimuksen tuloksista, tulisi vastaavanlainen tutkimus suorittaa uudestaan ottaen samalla huomioon mahdolliset vuodenaikaisvaihtelut hormonien erityksessä.