Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Browsing by Subject "CRISPR-Cas"

Sort by: Order: Results:

  • Regulation of Gene Expression at Posttranscriptional Level by Engineered Cas13 System In Vitro 
    Hietanen, Sakari (2022)
    Suuresta tarpeesta huolimatta, ei työvälineitä geeniekspression endogeeniseen säätelyyn ole nykypäivänä tarjolla lääketieteellisiin eikä tutkimuksellisiinkaan tarkoituksiin. Vuonna 2017 karakterisoitiin uuden CRISPR-Cas tyypin VI kompleksit. Nämä kompleksit hyödyntävät endonukleaasiaktiivisuudessaan uudenlaista Cas13 -efektoria, jonka kohteena toimii yksijuosteiset RNA-molekyylit. Cas13 tunnistaa kohteensa opas-RNA:n (gRNA) avulla. Tätä komplementaarisuutta hyödyntämällä on onnistuttu kohdistamaan Cas13:n aktiivisuus spesifisiin lähetti-RNA molekyyleihin nisäkässolukokeissa ilman kohde-RNA:n ulkopuolisia hajoamistuotteita. Tämän lisäksi nukleaasiinaktivoituja Cas13 efektoreita (dCas13) on käytetty esimerkiksi kohdennettuun nukleotidien deaminaatioon ja vaihtoehtoisen silmikoinnin indusointiin. Tämä todistaa dCas13 efektorien kyvyn toimia ohjelmoitavina apuproteiineina, joiden avulla voidaan ohjata kompleksiin liitetyn proteiinin toiminta spesifisille kohde-RNA:n alueille. Tässä tutkimuksessa, kaksi eukaryoottien translaatioon osallistuvaa proteiinia, ELAVL1 ja EIF4E, yhdistettiin dCas13b efektorin kanssa C- ja N-terminaalisesti, tarkoituksena lisätä kohteena olevan lähetti-RNA:n ekspressiota parantamalla tämän translatiivisuutta tai stabiliteettia. Koeasetelmassa vertailtiin näiden neljän fuusioproteiinin sekä aktiivisen Cas13b:n vaikutusta lusiferaasin ekspressioon käyttäen kuutta eri gRNA:ta aktivaation ohjaamisessa. Kokeet suoritettiin in vitro ympäristössä HEK293T-soluissa. Natiivi Cas13b vähensi merkittävästi lusiferaasisignaalia, kun taas samassa asetelmassa C-terminaalinen dCas13b-ELAVL1 fuusio lisäsi tätä tilastollisesti merkittävästi eli aikaansai kasvaneen lusiferaasiekspression. Vastaavaa vaikutusta ei ollut havaittavissa muissa fuusioproteiineissa. Tulokset todistavat onnistuneen Cas13b-välitteisen degradaation, sekä dCas13bELAVL1-välitteisen lisääntyneen lusiferaasitranskriptin translaation. Jatkotutkimusta vaaditaan fuusioproteiinin toiminnallisuuden ja varsinaisen kohteen ulkopuolisen aktiivisuuden määrityksessä. Siitä huolimatta tutkimuksessa esitelty fuusoproteiinikonstrukti voisi hyvin olla toimiva työkalu geeniekspression spesifin lisäyksen mahdollistamisessa endogeenisessa kontekstissa
  • Single Cell Readable Signal Recording System : Method Development 
    Jäntti, Joona (2024)
    Ovarian cancer is the most lethal gynaecological malignancy and is among the leading causes of cancer-related deaths among women. Chemotherapy resistance is a major obstacle in treating high-grade serous carcinoma (HGSC), leading to a low 5-year survival rate (35-40%). This resistance often develops even after the initial response to treatment. Cellular signalling changes are known to play a role in this process and transcription factors convey these signals of various pathways to transcriptional outputs. Understanding which pathways become active during treatment is crucial for developing new therapies and understanding how chemotherapy resistance develops. This thesis presents a novel method to record transcriptional pathway activation at single-cell level. It utilizes two plasmid constructs: one expressing doxycycline (DOX)-inducible Cas12a enzyme from Acidaminococcus (AsCas12a) and another containing single guide RNAs (sgRNA) under a stress-responsive promoter. The AsCas12a enzyme cleaves DNA at specific sites upon encountering the sgRNAs, leaving a permanent record of pathway activation. In the stress recording workflow that we developed the cells are first lentivirally transduced with both plasmid constructs. Then, treatment with DOX and a specific stress inducer (e.g., TNF-α for NF-κB pathway activation) jointly triggers targeted AsCas12a activity and genomic level records are produced. Our findings demonstrate tight control by both DOX and the stress inducer. No editing occurred without both plasmids and both inducers, demonstrating the system's timed activation. The method opens the door to studying the activation of different transcriptional pathways in HGSC. By simply modifying the response promoter sequence in the design, the system can be adapted to record various pathways. Ultimately, recording the activation of various pathways at the single-cell level holds promise for identifying key vulnerabilities of the adaptive mechanism that can be targeted for improved therapies in HGSC.

Yhteystiedot

HELSINGIN YLIOPISTO