Skip to main content
Login | Suomeksi | På svenska | In English

Browsing by Subject "Luciferase"

Sort by: Order: Results:

  • A reliable cytotoxicity assay to assess natural killer cell mediated killing of acute myeloid leukemia blasts 
    Veltman, Laurens (2024)
    Cell-based immunotherapies offer highly targeted treatment, potentially leading to higher response rates and reduced long-term side effects compared to chemotherapy. In the clinics, chimeric antigen receptor T-cell therapies are already being used as neo-adjuvant therapy for certain types of cancer, however, they can have significant drawbacks. Natural killer (NK) cells have emerged as a promising alternative option for targeting various hematological and solid tumors. Unlike T-cells, NK-cells do not need prior sensitization to the target and have the potential to be used as a allogeneic, ‘Off-the-shelf’, product. Acute myeloid leukemia (AML) is the most common type of acute leukemia in adults. Chemotherapy and small molecule drugs are typically used for the treatment of AML. However, the prognosis for relapsed or refractory AML patients remains unsatisfactory. Therefore, a collaborative project between the Helsinki Central Hospital and the Advanced Cell Therapy Center from the Finnish Red Cross, Blood Service was initiated to develop clinical-NK products targeting high-risk AML patients in Finland. A reliable and suitable in vitro cytotoxicity assay was required to assess the efficacy of NK cells before they could be given to AML patients. A luminescence-based method utilizing cellular ATP, was found to be the best performing method considering constraints such as the limited amount of patient material. AML blasts were successfully isolated from the whole blood of patients using CD33 microbeads and maintained in a composition of cytokines mix in RPMI media. The cytotoxicity assay paired with statistical analysis was able to identify significant differences in cytotoxic efficacy between NK cells from different donors. Additionally, results indicate improved cytotoxic efficacy in activated NK cells compared to non-activated NK cells, highlighting the usefulness of activated NK cells for use in the clinics.
  • Regulation of Gene Expression at Posttranscriptional Level by Engineered Cas13 System In Vitro 
    Hietanen, Sakari (2022)
    Suuresta tarpeesta huolimatta, ei työvälineitä geeniekspression endogeeniseen säätelyyn ole nykypäivänä tarjolla lääketieteellisiin eikä tutkimuksellisiinkaan tarkoituksiin. Vuonna 2017 karakterisoitiin uuden CRISPR-Cas tyypin VI kompleksit. Nämä kompleksit hyödyntävät endonukleaasiaktiivisuudessaan uudenlaista Cas13 -efektoria, jonka kohteena toimii yksijuosteiset RNA-molekyylit. Cas13 tunnistaa kohteensa opas-RNA:n (gRNA) avulla. Tätä komplementaarisuutta hyödyntämällä on onnistuttu kohdistamaan Cas13:n aktiivisuus spesifisiin lähetti-RNA molekyyleihin nisäkässolukokeissa ilman kohde-RNA:n ulkopuolisia hajoamistuotteita. Tämän lisäksi nukleaasiinaktivoituja Cas13 efektoreita (dCas13) on käytetty esimerkiksi kohdennettuun nukleotidien deaminaatioon ja vaihtoehtoisen silmikoinnin indusointiin. Tämä todistaa dCas13 efektorien kyvyn toimia ohjelmoitavina apuproteiineina, joiden avulla voidaan ohjata kompleksiin liitetyn proteiinin toiminta spesifisille kohde-RNA:n alueille. Tässä tutkimuksessa, kaksi eukaryoottien translaatioon osallistuvaa proteiinia, ELAVL1 ja EIF4E, yhdistettiin dCas13b efektorin kanssa C- ja N-terminaalisesti, tarkoituksena lisätä kohteena olevan lähetti-RNA:n ekspressiota parantamalla tämän translatiivisuutta tai stabiliteettia. Koeasetelmassa vertailtiin näiden neljän fuusioproteiinin sekä aktiivisen Cas13b:n vaikutusta lusiferaasin ekspressioon käyttäen kuutta eri gRNA:ta aktivaation ohjaamisessa. Kokeet suoritettiin in vitro ympäristössä HEK293T-soluissa. Natiivi Cas13b vähensi merkittävästi lusiferaasisignaalia, kun taas samassa asetelmassa C-terminaalinen dCas13b-ELAVL1 fuusio lisäsi tätä tilastollisesti merkittävästi eli aikaansai kasvaneen lusiferaasiekspression. Vastaavaa vaikutusta ei ollut havaittavissa muissa fuusioproteiineissa. Tulokset todistavat onnistuneen Cas13b-välitteisen degradaation, sekä dCas13bELAVL1-välitteisen lisääntyneen lusiferaasitranskriptin translaation. Jatkotutkimusta vaaditaan fuusioproteiinin toiminnallisuuden ja varsinaisen kohteen ulkopuolisen aktiivisuuden määrityksessä. Siitä huolimatta tutkimuksessa esitelty fuusoproteiinikonstrukti voisi hyvin olla toimiva työkalu geeniekspression spesifin lisäyksen mahdollistamisessa endogeenisessa kontekstissa

Yhteystiedot

HELSINGIN YLIOPISTO