Browsing by discipline "Elintarvikehygienia"

Clostridium botulinum is group of anaerobic rod shaped soil bacteria which causes serious food poisonings. It produces spores that can be found worldwide. The group is very heterogenic but the common thing to all C. botulinum bacteria is that they produce strong neurotoxin that causes paralysis and death. Human pathogens are C. botulinum types A, B, E, and F. Types C and D cause disease in animals. Aim of this study was to evaluate the prevalence of C. botulinum type A, B, E, and F spores in Finnish beef using multiplex PCR method. 53 samples of beef were processed in 2 separate pathways. Therefore 106 samples examined to search for C. botulinum types A B E and F with multiplex PCR. Process included sample pre-processes to eliminate PCR inhibitory substances and to concentrate C. botulinum cells. Results of the study were inconclusive. None of the beef samples were positive but the inoculated positive controls were working only half of the time in both pre-process pathways.

Clostridium botulinum on anaerobinen, gram-positiivinen, itiöivä sauvabakteeri, jota esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, meressä ja meren sedimenteissä. Se tuottaa maailman voimakkainta myrkkyä, botulinumneurotoksiinia (BoNT), joka aiheuttaa botulismina tunnetun velttohalvauksen estämällä asetyylikoliini -välittäjäaineen vapautumisen hermolihasliitoksen synapsiraossa. BoNT on n.150 kDa:n pituinen polypeptidiketju, joka koostuu disulfidisillalla yhdistetystä raskas- ja kevytketjusta. C. botulinum jaetaan kuuteen serotyyppiin A-F, joista C ja D aiheuttavat botulismia vain eläimillä. Linnut, turkiseläimet ja hevoset ovat herkimpiä C-tyypin toksiinille ja naudat ja pikkumärehtijät D-tyypille. Tyypit voidaan jakaa mikrobiologisten ominaisuuksiensa mukaan myös kolmeen ryhmään I-III. C- ja D- tyyppi muodostavat III-ryhmän, jolle on ominaista, että sen toksiinintuottogeeni sijaitsee bakteriofaagissa, toisin kuin muilla ryhmillä, joilla geeni kuuluu bakteerin kromosomiin. Bakteriofaagit ovat bakteerien loisviruksia, joita löytyy kaikkialta ympäristöstämme. Niillä on säännöllinen, usein kuusikulmainen pää ja tupellinen häntä. C- ja D-tyypin faagit sisältävät kaksijuonteista DNA:ta, jossa myös BoNT-geeni sijaitsee. Infektoidessaan bakteerin faagi siirtää DNA:nsa häntää pitkin bakteerin solulimaan. C- ja D-tyypin faagin suhde isäntäsoluunsa on pseudolysogeeninen, mikä tarkoittaa sitä, että faagi pystyy vaihdellen integroitumaan ja irrottautumaan bakteerin kromosomista. Integroiduttuaan kromosomiin faagi-DNA on lysogeenisessa syklissä eli se toimii osana isäntäsolun kromosomia ja periytyy sen mukana solun jälkeläisille. Irrottautuessaan kromosomista faagi-DNA joutuu solulimassa lyyttiseen sykliin, jossa se solun toimintaan puuttumatta monistaa itseään ja rakentaa päitä ja häntiä käyttöönsä. Lopulta uudet faagit rikkovat solun purkautuessaan siitä ulos. C- ja D-tyypit ovat toksigeenisiä ainoastaan infektoiduttuaan faagilla ja menettävät toksiinintuottokykynsä, jos faagi-DNA irrottautuu kromosomista. Faagityypistä riippuu, tuottaako solu C1- vai D-tyypin toksiinia. Kaikki faagit eivät kuitenkaan pysty infektoimaan kaikkia C- ja D-tyypin kantoja antigeenisista ja morfologisista eroista johtuen. Faagin menetykseen johtavia seikkoja ei tarkalleen tiedetä, mutta kasvulle epäedulliset ympäristöolot ja sarjasiirrostukset vähentävät kantojen toksigeenisyyttä. UV-säteilyllä ja erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä faagit saadaan irtoamaan keinotekoisesti. Neurotoksiinit syntetisoidaan ei-toksisten proteiinien kanssa osana suurempia, erikokoisia toksiinikomplekseja. Proteiinit osallistuvat BoNT:n suojaamiseen ja kiinnittymiseen. Kompleksin rakentamisesta vastaa kuusi geeniä, joita koodataan kolmessa rykelmässä kahteen eri suuntaan. Osalla proteiineista on hemagglutinaatioaktiivisuutta, jonka mukaan HA-geenit on nimetty. Diagnostiikassa hiirikokeet ovat paljolti väistyneet uusien menetelmien tieltä, vaikka ne ovatkin yhä ainoa varma keino todeta toksiinin aktiivisuus. Immunologisista menetelmistä ELISA:a on paljon hyödynnetty C- ja D-tyypeillä. Detektioon on käytetty PCR:ää, mutta modernimpien geeniteknisten tyypitysmenetelmien osalta ei ole vielä julkaistuja tutkimustuloksia C- ja D-tyypeiltä. Sen sijaan ihmisbotulismia aiheuttavia tyyppejä on paljon tutkittu mm. ribotyypityksellä, PFGE:llä ja AFLP:llä.

Clostridium botulinum on gram-positiivinen itiöllinen anaerobinen sauvabakteeri. Epäsuotuisissa kasvuolosuhteissa bakteeri tuottaa lämpökestävän itiön. Bakteerin itiöitä esiintyy yleisesti maaperässä ja vesistöjen sedimenteissä. Clostridium botulinumin vegetatiivisten solujen tuottama toksiini on yksi vahvimmista myrkyistä ja se voi sairastuttaa sekä ihmisiä että eläimiä. Hevonen on erittäin herkkä botulinumtoksiinille. Maailmalla on raportoitu useita tapauksia, joissa pilaantunutta rehua syöneet hevoset ovat sairastuneet ja kuolleet myrkyn aiheuttamiin halvausoireisiin. Myös Suomessa on raportoitu botulismiepäilyjä, jotka ovat liittyneet pilaantuneen säilörehun syöttämiseen. Tässä tutkimuksessa selvitettiin C. botulinum tyyppien A, B, E ja F itiöiden mahdollista esiintymistä hevosen ulosteessa laidunkaudella. Työni liittyy osana tutkimukseen, jossa selvitetään C. botulinumin itiöiden esiintyvyyttä hunajassa. Mehiläisten tiedetään käyttävän vettä pesän lämmönsäätelyyn ja omaksi ravinnokseen. Tarvitsemansa veden mehiläiset hakevat lantaloista ja lantakasoista ja näin ollen on mahdollista, että hevosen uloste voisi toimia mahdollisena kontaminaatiolähteenä. Suomessa ei ole aikaisemmin tutkittu C. botulinumin itiöiden esiintymistä hevosen ulosteessa. Näytteet kerättiin eläinlääkäreiden ja eläinlääketieteen kandidaattien avustuksella sadalta hevoselta eri puolilta Suomea. Näytteenottotiloilla eläinlääkäri täytti hevosen omistajan tai tallinpitäjän avustuksella kyselykaavakkeen, jonka avulla selvitettiin mm. hevosten ruokintaa, vedensaantia ja laidunolosuhteita. C. botulinumin detektio tehtiin rikastuksen jälkeen multiplex-PCR –menetelmällä. Itiöiden määrä määritettiin MPN (Most Probable Number) –menetelmää käyttäen. Näytteistä punnittiin 1 g:n erissä kymmenen putken sarjat, joista positiivisen tuloksen antaneiden putkien lukumäärästä MPN-luku laskettiin. Käytetyllä menetelmällä hevosen ulostenäytteistä havaittiin C. botulinumin suhteen positiivisiksi 16 (16%) näytettä. Kaikki positiiviset näytteet sisälsivät tyypin B itiöitä. Tulos on sopusoinnussa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksella meneillään olevan tutkimuksen kanssa, jossa C. botulinum tyyppiä B todettiin esiintyvän Suomen maaperässä. Ulostenäytteistä löydettyjen itiöiden määrä vaihteli 11-69 kpl itiöitä/100 g näytettä keskiarvon ollessa 28 itiötä/100 g näytettä. Kyselytutkimuksen aineisto analysoitiin c2 –testin avulla. Kysyttyjen muuttujien suhteen ei havaittu tilastollisesti merkittäviä eroja positiivisten ja negatiivisten hevosten välillä (p>0,05). Tämän tutkimuksen perusteella hevosen uloste voi toimia mahdollisena kontaminaatiolähteenä hunajassa esiintyville C. botulinumin itiöille.

Clostridium botulinum on itiöitä muodostava gram-positiivinen sauvamainen anaerobibakteeri, jota tavataan yleisesti maaperässä ja vesistöissä ympäri maailmaa. Maaperästä ja vesistöistä se siirtyy helposti itiöidensä avulla kasveihin ja kaloihin, sekä myös muihin ihmisten käyttämiin elintarvikkeisiin. C. botulinum tuottaa lisääntyessään maailman myrkyllisimpänä aineena tunnettua neurotoksiinia, jota kutsutaan botulinumtoksiiniksi. C. botulinum jaetaan serotyyppeihin A, B, C, D, E, F ja G, joista tyypit A, B, E ja F ovat tavallisimpia humaanibotulismin aiheuttajia. Botulismia tavataan ihmisillä neljässä eri muodossa: klassinen ruokamyrkytysbotulismi, haavabotulismi, imeväisbotulismi sekä suolistobotulismi. Imeväisbotulismi on alle vuoden ikäisillä pikkulapsilla esiintyvä sairaus, joka aiheutuu C. botulinum –itiöiden germinoituessa ja tuottaessa toksiinia lapsen suolistossa. Sairaudella on erilaisia vakavuusasteita lievistä oireista äkkikuolemaan (kätkytkuolema) ilman edeltäviä oireita. Hunaja on toistaiseksi todettu ainoaksi vehikkelielintarvikkeeksi imeväisbotulismitapauksissa. C. botulinumin prevalenssia hunajassa on tutkittu useissa eri maissa ja itiöitä on todettu esiintyvän noin 0-20 %:ssa tutkituista näytteistä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää C. botulinum –itiöiden prevalenssia ruotsalaisessa hunajassa, sekä arvioida saadun tuloksen perusteella sisältääkö ruotsalaisen hunajan syöttäminen pikkulapsille imeväisbotulismiriskin. Hunajanäytteet (61 kpl) esikäsiteltiin ja tutkittiin multiplex-PCR-menetelmällä ja pyrittiin osoittamaan näytteissä mahdollisesti esiintyvä C. botulinum -serotyypin A, B, E tai F neurotoksiinigeeni. Tutkituista hunajanäytteistä löytyi vain yksi positiivinen näyte, jolloin C. botulinum –itiöiden prevalenssi ruotsalaisessa hunajassa on tämän tutkimuksen mukaan 2 %. Tulos vastaa suuruusluokaltaan muissa pohjoismaissa saatuja tuloksia. Löydetty C. botulinum –organismi oli serotyyppiä E. Näytteet olivat peräisin lingotusta hunajasta, joten suoraan mehiläispesistä tai kennostoista otetuissa näytteissä prevalenssi olisi saattanut osoittautua suuremmaksi. Saadun tuloksen perusteella voidaan siis ruotsalaisen hunajan syöttämisen alle vuoden ikäisille lapsille katsoa sisältävän imeväisbotulismiriskin. Alhaisen prevalenssin vuoksi riski on kuitenkin vähäinen.

Clostridium perfringes tyyppi A on yleinen ruokamyrkytyksien aiheuttaja etenkin joukkoruokailuihin liittyvissä tapauksissa. Riskitekijöinä on mm. hidas jäähdytys, pitkät tarjoiluajat ja uudelleen lämmitys. Ruokamyrkytyksiä aiheuttavat C. perfringens -kannat tuottavat enterotoksiinia (CPE), jota vapautuu sporulaation yhteydessä ohutsuolessa. Enterotoksiini on n. 35 kDa:n kokoinen polypeptidiketju, jonka tuotantoa koodaa yksi geeni, cpe. Geeni voi sijaita joko bakteerin kromosomissa tai plasmidissa. Ruokamyrkytystapauksista eristetyissä kannoissa sen on todettu sijaitsevan kromosomissa. Geenin olemassaolo voidaan todeta PCR-tekniikalla. PCR eli polymeraasiketjureaktio on reaktio, jossa DNA:ta monistetaan tunnettujen alukkeiden ja polymeraasientsyymin avulla. Reaktiossa on kolme vaihetta (avautuminen, kiinnittyminen ja pidentäminen), jotka muodostavat yhden syklin. Toistamalla sykliä tuotteen määrä kasvaa eksponentiaalisesti. Tutkimuksen kohteena oli 47 elintarvikkeista eristettyä C. perfringens -kantaa, joiden cpe-positiivisuutta tutkittiin PCR-tekniikalla. Tutkimuksessa käytettiin kahta eri PCR-ohjelmaa (CPE 1 ja CPE 2) ja kahta alukeparia (CPE 1 / 2 ja CPE 3 / 4). Saadut tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tutkituista kannoista kaksi oli cpe-positiivisia. Muut kannat olivat negatiivisia. Positiivisten kantojen osuus oli 4 % kokonaismäärästä, mikä tukee aikaisempien tutkimusten tuloksia siitä, että vain osalla C. perfringens -kannoista on cpe-geeni.

Clostridium perfringens on yleinen ruokamyrkytyksiä aiheuttava bakteeri. Ruokamyrkytyksen oireiden uskotaan johtuvan C. perfringensin tuottamasta enterotoksiinista (CPE). C. perfringens on yleinen ihmisten ja eläinten suolistossa sekä maaperässä, mutta vain noin 5 % eristetyistä kannoista on kantanut cpe-geeniä. Mahdollisina lähteinä ruokamyrkytyksissä pidetään liharuokia. Erityisesti suolensisältöä pidetään tärkeänä kontaminaation lähteenä lihaan. C. perfringensiä esiintyy yleisesti terveen broilerin suolistossa. Teurastusprosessin aikana broilerin suolensisältö voi levitä ja kontaminoida broilerin lihan sekä käsittely-ympäristön. Vain pieni osa C. perfringens-kannoista, jotka on eristetty nykytekniikoilla broilerin ulosteesta, on cpe-positiivisia. C. perfringensin geneettisestä diversiteetistä eli monimuotoisuudesta terveillä eläimillä ei ole paljon tietoa. C. perfringens-kantojen geneettisestä tyypityksestä olisi hyötyä epidemiologisiin tutkimuksiin. Tämä tutkimus oli osa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksen kesäkoulua 2004. Tutkimuksessa haluttiin selvittää kuinka suurella osalla teurastetuista broilereista Suomessa esiintyy cpe-positiivista C. perfringensiniä nested PCR-menetelmällä osoitettuna. Tyypityksen avulla cpe-positiivisista näytteistä tutkittiin geneettistä diversiteettiä eli C. perfringens-kantojen monimuotoisuutta parven sisällä sekä eri tuottajilta peräisin olevilla linnuilla. Kantojen cpe-positiivisuus osoitettiin käyttäen nested PCR-menetelmää. Kantojen geneettistä diversiteettiä tutkittiin PFGE:n avulla. Tässä tutkimuksessa sadasta broilerin suolensisältörikastenäytteestä seitsemän (7 %) tulkittiin cpe-positiivisiksi. Vain neljästä cpe-positiivisesta näytteestä saatiin eristettyä C. perfringens tyypitystä varten. Näistä neljästä näytteestä eristettiin yhteensä 38 isolaattia. Tyypitettyä saatiin kahdeksan isolaattia, jotka olivat peräisin kahdelta saman tuottajan broilerilta. Seitsemällä isolaatilla oli identtinen PFGE-profiili ja yksi oli läheistä sukua näiden kanssa. Loput isolaateista jäivät tyypittymättä todennäköisesti bakteerin tuottamien voimakkaiden DNaasien aiheuttaman DNA:n hajoamisen seurauksena.

The purpose of the study was to determine the occurrence of various genotypes of cpe gene-carrying (cpe-positive) Clostridium perfringens type A and the general occurrence of C. perfringens in the scalding water before and after the scalding of pigs. The scalding water was collected from one small slaughterhouse on 6 different days. The scalding water was filtered through a hydrophobic grid membrane and the bacteria were grown on tryptose-sulfite-cycloserine (TSC) agar. The cpe-positive C. perfringens strains were found from the grid membrane using colony hybridization. By combining colony hybridization with grid membrane filtration it is possible to examine tens of thousands of colonies and isolate the cpe-positive C. perfringens strains among the colonies using only small sample sizes. The isolated C. perfringens strains were confirmed by multiplex PCR. Specific primers have been created to recognise various types of C. perfringens. Using these primers the existence of the genes coding alpha (cpa), beta (cpb), epsilon (etx), iota (iA) and enterotoxins (cpe) in the sample being examined can be determined. C. perfringens was found in five samples (83 %) taken after the scalding. C. perfringens was found in only one (17 %) sample taken before the scalding. There were no C. perfringens found in one (17 %) of the batches of samples. All isolated C. perfringens were type A. None of the isolates carried the cpe gene. Based on the present study the scalding water could not be shown to be a remarkable reservoir of strains of the cpe-positive C. perfringens type A. However cpe negative C. perfringens type A could be found in all but one batch of samples taken from the scalding water so it is possible that cpe positive strains will also end up in the water.

Clostridium perfringens on ruokamyrkytystä aiheuttava anaerobi, itiöitä muodostava bakteeri, jota esiintyy yleisesti maaperässä, jätevesissä sekä ihmisten ja eläinten suolistossa. Bakteeri tuottaa yhteensä ainakin 16 virulenssitekijää, mm. 12 eri toksiinia. C. perfringens jaetaan viiteen tyyppiin (A-E) tuottamiensa neljän päätöksiinin perusteella. Eri bakteerityypit aiheuttavat ihmisillä ja eläimillä hyvin erilaisia sairauksia, kuten kaasukuoliota ja nekroottista enteriittiä. C. perfringens-enterotoksiini (CPE) aiheuttaa ihmisellä tyyppi A ruokamyrkytyksen. Ruokamyrkytys liittyy usein joukkoruokailuun, jossa suuria määriä ruokaa valmistetaan kerralla ruuan jäähdytyksen kestäessä liian kauan, tarjoiluajan ollessa pitkän tai uudelleen kuumennoksen ollessa riittämätöntä. Näissä oloissa suhteellisen lämmönkestävä C. perfingens pääsee lisääntymään. Ruokamyrkytyksen oireet, ripuli ja vatsakivut, aiheutuvat enterotoksiinin vapautuessa ohutsuolessa sporuloituvista bakteerisoluista ja vaurioittaessa suolen epiteelisoluja. Ruokamyrkytys on usein yhteydessä liharuokiin, joten ruokamyrkytystä aiheuttavien C. perfringensin reservuaarina on pidetty eläimiä. Kuitenkin vain pienellä osalla eläinperäisistä C. perfringens –kannoista on enterotoksiinin muodostusta koodaava cpe-geeni. Tehdyissä tutkimuksissa enterotoksiinipositiivisten C .perfringensien määrät vaihtelevat eläinlajista toiseen ja tutkimuksesta toiseen. Vielä on epäselvää, mistä enterotoksiinipositiiviset C. perfringensit joutuvat ruokaan. Tämä tutkimus on osa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksen projektia, jossa selvitetään C. perfringensin epidemiologiaa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää esiintyykö naudan ulosteessa enterotoksiinipositiivisia C. perfringens –kantoja ja tutkia, vaikuttaako lämpökäsittely 100°C:ssa 15 minuuttia cpe-geenin esiintyvyyteen. C. perfringens –kannat eristettiin ulostenäytteistä modifioidun PEMK:n (Pohjoismainen elintarvikkeiden metodiikkakomitea) menetelmäehdotuksen mukaisesti. Cpe-geenin esiintyminen tutkittiin PCR-menetelmällä. C. perfringensiä oli naudan ulostenäytteissä 41 %:lla. Kantoja saatiin eristettyä 77 kappaletta. Yhtään cpe-geenin suhteen positiivista bakteerikantaa ei löytynyt. Tulokset ovat yhteneviä aikaisempien tutkimustulosten kanssa. Kuumennuskäsittelyn vaikutusta enterotoksiinipositiivisten kantojen esiintyvyyteen ei pystytty arvioimaan.

Clostridium botulinum is an anaerobic rod shaped bacterium. It forms endospores that are commonly found in soils and aquatic sediments. C. botulinum produces one of the most potent neurotoxins that causes dangerous neuroparalytic disease called botulism. Food-borne botulism is an intoxication due to ingestion of preformed neurotoxin in foods. When favouring minimally processed food which safety depends almost only on chilled storage the risk of neurotoxin formation increases. It is essential to know the mechanisms of cold tolerance of C. botulinum when improving the safety of high-risk foods. A rapid temperature downshift causes decrease in the synthesis of most of the proteins in the cell. However the synthesis of structurally related cold shock proteins (Csp) reaches the maximum level after cold shock. It is assumed that these proteins are important for bacterial cold shock response. The exact function and meaning of cold shock proteins is not fully understood but they are believed e.g. to inhibit the formation of unwanted secondary structures of nucleic acids and regulate the synthesis of other proteins. The genome of C. botulinum ATCC 3502 strain contains three cold shock protein coding genes: cspA, cspB and cspC. The meaning of the cold shock proteins for the growth of ATCC 3502 was studied by comparing the growth of wild type strain and cspB- and cspC -mutant strains at different temperatures. The alterations in the expression of cspA-, cspB- and cspC -genes after cold shock were also studied. The results confirm that cspB and cspC genes are related to cold tolerance of the C. botulinum ATCC 3502 strain. cspB and cspC mutant strains grew at 20 °C at a reduced rate compared to C. botulinum ATCC 3502 wild type strain. There was no difference in growth rate between the strains grown at 37 °C and 44 °C. With quantitative RT-PCR, a significant twofold increase in the expression of cspA and cspB was detected for C. botulinum ATCC 3502 wild type strain while the expression of cspC stayed at normal level after cold shock. In cspB mutant strain the expression of cspA increased almost fivefold after cold shock. In cspC mutant strain after cold shock the trend of the expression of the other csp-genes was to decrease or stay at normal level. The results of quantitative RT-PCR method indicate some ability of csp genes to compensate for the functions of down regulated csp gene by other csp genes.

The Purpose of the Finnish Hygiene Act (The Act on Food Hygiene of Foodstuff of Animal Origin 1195/1996), which was in force until the beginning of March 2006, was to ensure the hygienic quality of foodstuffs of animal origin and prevent the spread of infections from animals to humans via foodstuffs. The Hygiene Act applied to handling, hygienic quality requirements and inspections prior to retail of foodstuff of animal origin. The aim of official food control is to ensure that establishments fulfil the requirements imposed on them by the legislation. According to The Hygiene Act, abattoirs and establishments connected to them were controlled by an official veterinarian working for The National Food Agency, and other establishments controlled by the municipal authorities. Each municipality or federation of municipality was responsible for the official control in its own region. The inspection frequencies depended on the type of establishment, but all establishments had to be inspected regularly. The purpose of this study was to investigate how official control was perceived in establishments covered by the Hygiene Act in terms of effects and congruence of the official control and guidance received from the authorities. The aim was also to investigate the influence of control frequency on perceptions on effects, congruence and guidance. The research was performed in spring 2006 using a questionnaire, which was issued to all establishments in meat branch, establishments handling fishery products, dairy plants, egg packing centres and warehouses of foodstuffs of animal origin registered as approved establishments by The National Food Agency in 2005. 459 answers were received, which was 36 % of the questionnaires sent. The results show that the food control had improved the hygiene of the establishments according to the perceptions of the establishments. Product safety was considered to be improved by the official control more in small and medium-sized establishments than in large establishments. EU-establishments in meat branch have made more changes to their production processes and line of production due to food control than other types of establishments. Approximately one half of the respondents were unable to provide a view on congruence of official control. Incongruence was experienced most frequently in low-capacity slaughterhouses. High inspection frequency was found to be connected to the experience of incongruence. The higher the inspection frequency, the higher was the perceived incongruence of official control. Most establishments were satisfied with the amount of guidance concerning the legislation they had been given by the official inspector. However, more guidance was needed on the planning of the own-check, construction of production facilities, expansion and repair of production facilities and correction of the shortcomings found during inspections. The frequency of inspections was also found to have an effect on perceived benefit of official control. The more frequent the control inspections performed by the municipal control authorities were, the higher was the perceived positive impact on hygiene.