Browsing by Subject "Clostridium botulinum"

Clostridium botulinum is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming bacterium that is found widely in nature. C. botulinum produces highly potent neurotoxin which causes paralysis. Yet, it is not known why the toxin is produced. C. botulinum poses a risk for the food industry, when spores germinate in food and start producing toxin. The aim of this study was to report how different carbohydrates and metabolites affect growth, toxin production and sporulation of C. botulinum. The hypothesis was that different substrates have different influence on the metabolism of C. botulinum. Earlier studies show which carbohydrates are utilized by C. botulinum but only few relate nutrient availability to toxin production. Glucose is the far most studied carbohydrate and it is known to support growth and toxin production. Growth in defined medium with added substrates was measured with Bioscreen. The method is based on measuring optical density of the cultures; optical density increases when the bacteria divide. Toxin levels were measured from 1 d and 5 d samples with a commercial ELISA (ELISA, enzyme-linked-immunosorbent-assay). The number of spores produced was measured after five days of growth. Vegetative cells were destroyed by heating (10 min, 80 °C) and MPN-method was conducted (MPN, most-probable number). With added glucose and glucose derivates (trehalose, maltotriose), growth and toxin production were induced most compared to control medium. High spore numbers were also measured. Higher concentrations of these substrates supported growth more than the lower concentrations. With higher concentrations of glucose and maltotriose the toxin levels were lower compared to low concentrations. With trehalose toxin levels were similar at high and low concentration. It can be concluded that the maximal growth density alone does not determine the toxin levels. N-acetylglucosamine (GlcNAc), which is found in bacterial cell walls, supported growth similar to glucose. GlcNAc supported also high sporulation and toxin production. Even though GlcNAc is a major component of chitin (e.g. the insect exoskeleton), chitin did not support toxin production or sporulation as efficiently as GlcNAc. The results indicate that C. botulinum might favor environments with fungi, dead bacteria or degraded chitin. By utilizing compounds from dead bacteria or insects, C. botulinum might have a role in circulating nutrients in anaerobic environment.

Clostridium botulinum is group of anaerobic rod shaped soil bacteria which causes serious food poisonings. It produces spores that can be found worldwide. The group is very heterogenic but the common thing to all C. botulinum bacteria is that they produce strong neurotoxin that causes paralysis and death. Human pathogens are C. botulinum types A, B, E, and F. Types C and D cause disease in animals. Aim of this study was to evaluate the prevalence of C. botulinum type A, B, E, and F spores in Finnish beef using multiplex PCR method. 53 samples of beef were processed in 2 separate pathways. Therefore 106 samples examined to search for C. botulinum types A B E and F with multiplex PCR. Process included sample pre-processes to eliminate PCR inhibitory substances and to concentrate C. botulinum cells. Results of the study were inconclusive. None of the beef samples were positive but the inoculated positive controls were working only half of the time in both pre-process pathways.

Clostridium botulinum on elintarvikevälitteinen patogeeni, joka tuottaa voimakkainta tunnettua myrkkyä botuliinitoksiinia. Botuliini on hermomyrkky, joka aiheuttaa botulismia sekä ihmisille että eläimille estämällä välittäjäaineen vapautumisen hermo-lihasliitoksessa. Hengityslihaksistoon edetessään botulismi on hoitamattomana mahdollisesti kuolemaan johtava sairaus. C. botulinum kannan ATCC 3502 botuliinitoksiinikompleksi koostuu toksiiniosasta (BoNT/A1), nonhemagglutiniiniosasta (NTNH) ja kolmesta hemagglutiniiniosasta (HA-17, HA-33 ja HA-70). Toksiinikompleksin osia koodaavat geenit sijaitsevat samassa lokuksessa ja muodostavat kaksi erillistä operonia. Operonien välissä sijaitsee geeni (botR), joka koodaa toksiinituotantoa säätelevää BotR-sigmatekijää. C. botulinum tuottaa itiöitä, jotka ovat ympäristössä hyvin kestäviä. Itiöitymisen pääsäätelijänä toimii Spo0A, joka aktivoituessaan aktivoi edelleen sigmatekijäkaskadin. Tässä säätelykaskadissa emosolun puolella itiöitymistä ohjaavia rakennegeenejä säätelevät SigE ja SigK, ja esi-itiön puolella SigF ja SigG. Tutkimus koostui kahdesta eri osasta. Tutkimuksen metodologisessa osassa I oli tarkoituksena arvioida pienistä bakteeripopulaatioista saatavaa RNA-määrää ja sen laatua. RNA:n tutkimusmenetelmiin vaaditaan tyypillisesti suuria määriä hyvälaatuista RNA:ta, ja menetelmästä riippuen tarvittava määrä vaihtelee 200 nanogrammasta 5:een mikrogrammaan. Tarkoituksena oli selvittää, kuinka paljon bakteerisoluja tarvitaan RNA-sekvensointiin ja RT-qPCR-menetelmään. Tutkimuksessa käytetyt bakteerisolupelletit säilytettiin -70°C:ssa ja niistä eristettiin RNA. Tutkimuksen biologisessa osassa II oli tarkoituksena vertailla kahden eri C. botulinum ATCC 3502 -kannan isolaatin transkriptioprofiilia toksiinituotantoon ja itiöitymiseen liittyvien geenien osalta. Isolaattien transkriptioprofiilin avulla saatiin tietoa siitä, mitkä geenit ilmentyvät solussa tietyllä ajanhetkellä. ATCC 3502 -kannan isolaatti tox+ tuottaa botuliinia, kun taas kannasta laboratorio-olosuhteissa spontaanisti mutatoitunut isolaatti tox- tuottaa botuliinia huomattavasti vähemmän. Neurotoksiinituotantokyvyn lisäksi myös isolaattien itiöitymiskyvyn tiedetään eroavan toisistaan. Tox--isolaatin itiöitymiskyky on aikaisempien tutkimusten perusteella heikentynyt. Tox+- ja tox--isolaattien aiempi genomianalyysi toi esiin tärkeitä eroavaisuuksia niiden genotyyppien ja fenotyyppien suhteen. Tox--isolaatin vaihtoehtoista sigmatekijää BotR koodaavasta geenistä (botR) löydettiin geenin lukukehyksen muuttava insertiomutaatio. Molemmat isolaatit (tox+ ja tox-) kasvatettiin identtisissä olosuhteissa (anaerobinen TPGY-liemikasvatusalusta, 37 °C), ja bakteereiden eri kasvuvaiheista eristettiin solunäytteet. Bakteerisoluista eristettiin RNA, jonka perusteella valmistettua cDNA:ta käytettiin templaattina kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa RT-qPCR-analyysissa. RT-qPCR-menetelmän avulla tutkittiin kohdegeenien (botA, ha33, spo0A, sigF, sigE ja sigG) ilmentymistä bakteerin eri kasvuvaiheissa. Referenssigeeninä käytettiin 16S rRNA:ta. Geenien esiintymiselle muodostettiin suhdeluvut, joiden perusteella isolaattien transkriptioprofiileja verrattiin toisiinsa. Tutkimuksen osion II tulokset osoittavat, että botuliinin rakennegeenien (botA ja ha33) ilmentyminen tox+-isolaatilla oli suurimmillaan 30–65-kertaisesti (p<0,05) suurempaa kuin tox--isolaatilla. Tuloksen avulla voidaan selittää aikaisemmissa tutkimuksissa havaittu ero isolaattien neurotoksiinituotannossa. spo0A-geenin ilmentyminen oli enimmillään noin 30-kertaisesti suurempaa tox+-isolaatilla kuin tox--isolaatilla, mutta ero ei ollut näin suuri eikä tilastollisesti merkitsevä solupopulaatioiden kaikissa kasvuvaiheissa. Itiöitymisen sigmatekijöitä koodaavien geenien (sigE, sigF ja sigG) kohdalla erot isolaattien välillä olivat suurempia kuin spo0A-geenin kohdalla. Geenien ilmentyminen oli yleisesti 20–30-kertainen tox+-isolaatilla tox--isolaattiin nähden. Saadun tuloksen avulla voidaan selittää isolaatin tox- heikentynyt kyky itiöityä. Toksiinituotannolla ja itiöitymisellä on siten todennäköisesti yhteisiä säätelymekanismeja ja/tai -signaaleja. Mutaatio BotR sigmatekijässä todennäköisesti vaikuttaa myös itiöitymisen säätelyyn. On todennäköistä, että C. botulinumin itiöitymisen säätelykaskadi osallistuu myös toksiinituotannon säätelyyn. Tutkimus antaa tärkeää lisätietoa C. botulinumin itiöitymisen ja toksiinituotannon säätelystä saman kannan eri tavoin käyttäytyvillä solupopulaatioilla. Tutkimuksen osiosta I saatujen tulosten perusteella bakteerisolujen ja niistä eristettävän RNA-määrän välille saatiin standardisuora. Saatua tietoa voidaan hyödyntää RNA-sekvensoinnin ja RT-qPCR:n tutkimuskäytössä. Saatujen tulosten avulla voidaan laskea halutun RNA-massan perusteella soluviljelmään tarvittava bakteerisolumäärä, tai vastaavasti kuinka suuri määrä RNA:ta on mahdollista saada tietyn kokoisesta bakteerisolupopulaatiosta. Tutkimuksen osiosta II saatujen tulosten perusteella C. botulinumin itiöitymisprosessi ja toksiinituotanto linkittyvät siis toisiinsa useaa eri reittiä pitkin, ja vaikuttavat näin toinen toisensa säätelyyn. Tärkeänä tekijänä niiden välillä useimmilla C. botulinum –kannoilla toimii vaihtoehtoinen sigmatekijä BotR, joka toksiinituotannon säätelyn lisäksi linkittyy myös itiöitymisprosessin säätelyyn mitä todennäköisimmin orpokinaasien välityksellä säätelemällä Spo0A:n fosforyloitumista.

Clostridium botulinum on anaerobisissa olosuhteissa kasvava grampositiivinen sauvabakteeri. Se tuottaa hermomyrkkyä, botulinumneurotoksiinia, joka voi aiheuttaa ihmisen tai eläimen elimistöön päästessään botulismi-nimisen sairauden. Botulismi voi johtaa hoitamattomana hengityslihasten halvaukseen ja kuolemaan. Bakteeri muodostaa epäsuotuisia olosuhteita kestäviä lepomuotoja, itiöitä, jotka voivat säilyä muun muassa elintarviketeollisuuden kuumennusprosesseissa ja kylmäsäilytyksessä. Säilytyksen aikana itiö voi muuttua takaisin lisääntymiskykyiseen muotoonsa ja alkaa tuottaa botulinumneurotoksiinia. C. botulinumin itiöitä esiintyy maailmanlaajuisesti maaperässä, vesistöissä ja eläinten suolistoissa. Kuten moni muukin mikrobi, C. botulinumin itiöt voivat päätyä ympäristöstä elintarvikeketjuun. Kansainvälisiin tutkimuksiin perustuen itiöiden esiintyvyys valmisruokien liharaaka-aineissa on 0–10 %. Itiöitä on näytteissä ollut 2–4 itiötä/kg. Suomessa liharaaka-aineita ei ole tutkittu, mutta kalassa ja hunajassaitiöiden esiintyvyydet ovat olleet 5–40 %. Liharaaka-aineiden itiökontaminaation selvittäminen on tärkeää, jotta voidaan arvioida itiöiden valmisruokateollisuudelle asettamat riskit ja tarvittaessa optimoida valmisruokateollisuuden käytössä olevia valmistusprosesseja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, esiintyykö suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa C. botulinumin itiöitä. Tutkimuksessa käytettiin CEN ISO/TS 17919:2013 - standardimenetelmää, joka perustuu botulinumneurotoksiinigeenien (tyypit A, B, E ja F) osoittamiseen näytemateriaalista eristetystä bakteeri-DNA:sta reaaliaikaisella PCR-tekniikalla. Tutkimuksessa tutkittiin yhteensä 87 broilerin- ja sianlihanäytettä. Kansainvälisiin tutkimuksiin ja suomalaisiin kala- ja hunajatutkimuksiin perustuen hypoteesiksi asetettiin se, että myös suomalaisissaelintarvikeraakaaineissa voisi olla itiöitä eli yksi tai useampi tutkittava näyte noin 90 tutkittavasta näytteestä olisi botulinumneurotoksiinigeenin suhteen positiivinen. Kaikki tutkitut näytteet olivat botulinumneurotoksiinigeenin suhteen negatiivisia. Kontrollinäytteet antoivat positiivisen tuloksen, kun näytteisiin lisätyt itiömäärät olivat 3 itiötä/kg tai enemmän. Näytteissä oli näin ollen vähemmän kuin 3 itiötä/kg. Tutkimusten mukaan elintarvikkeet kontaminoituvat itiöillä jonkin verran, mutta tämän työn perusteella suomalaisessa broilerissa ja sianlihassa näyttää esiintyvän vain vähän tai ei ollenkaan C. botulinumin itiöitä. Suuremman näytemäärän tutkiminen vahvistaisi negatiivisen tuloksen luotettavuutta ja auttaa arvioimaan lihapohjaisiin valmisruokiin liittyvää C. botulinum -riskiä.

Clostridium botulinum on gram-positiivinen itiöitä muodostava sauvamainen anaerobibakteeri, jota esiintyy yleisesti ympäristössä. C. botulinum tuottaa myrkyllisintä tunnettua yhdistettä, botuliinineurotoksiinia. Botuliinineurotoksiini aiheuttaa ihmisille ja eläimille botulismina tunnettua halvaussairautta, joka voi johtaa hoitamattomana jopa kuolemaan. Etenkin C. botulinum ryhmä II on elintarvikehygienian kannalta merkittävä, sillä ryhmän bakteerit kasvavat jääkaappilämpötiloissa, mikä aiheuttaa riskin jääkaapissa säilytettävien elintarvikkeiden turvallisuudelle. C. botulinum -bakteerin itiöinnin ja toksiinintuotannon geneettisiä säätelymekanismeja ei vielä tunneta täysin. Jotta voisimme saada lisää tietoa keinoista parantaa elintarvikkeiden turvallisuutta, on tärkeää saada lisää tietoa etenkin bakteerin toksiinintuotannosta. Koska on viitteitä siitä, että toksiinintuotannon ja itiöinnin välillä olisi yhteistä geneettistä säätelyä, on myös tärkeää saada lisää tietoa bakteerin itiöinnistä. Lisensiaatintutkielman tutkimusosassa tutkittiin uudella CRISPR-Cas9-menetelmällä valmistettuja kantoja. C. botulinum ryhmän II Beluga-kannasta oli yksitellen deletoitu geenit spo0A, sigK, orfX2 ja amyE. Tutkimuksessa selvitettiin, miten deleetio vaikuttaa bakteerien kasvuun, itiöintiin, toksiinintuotantoon ja solumorfologiaan. Bakteerikasvua seurattiin mittaamalla spektrofotometrilla optista tiheyttä sekä MPN (most probable number) -menetelmällä bakteerimääriä. Itiöintiä mitattiin kuumentamalla näytteitä vegetatiivibakteerien tuhoamiseksi ja edelleen MPN-menetelmällä. Toksiinintuotantoa mitattiin immunologisella ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) -testillä. Solujen morfologiaa tutkittiin gram- ja itiövärjäyksillä. spo0A ja sigK ovat keskeisiä itiöintiin vaikuttavia geenejä. Tutkimuksessa spo0A-geenimutantti (∆spo0A) ei itiöitynyt ollenkaan, ja spo0A-geenin deleetio vaikutti negatiivisesti bakteerien kasvuun. ∆sigK ei kyennyt itiöitymään, mutta itiövärjäyksessä havaittiin malakiittivihreällä värjäytyviä esi-itiöitä emosolujen sisällä. Todennäköisesti itiöinti on siis keskeytynyt vaiheessa IV, ja sigK-geeni säätelee itiöiden kuorikerroksen muodostumista. ∆sigK- ja ∆spo0A-kantojen toksiinintuotanto oli myös vähäisempää kuin mutatoimattoman kannan, mikä viittaa siihen, että toksiinintuotannon ja itiöinnin välillä on yhteistä geneettistä säätelyä. Molempien mutanttikantojen kohdalla toksiinia kertyi bakteerisolujen sisälle. Koska mutanttikannat eivät itiöityneet ollenkaan, saattaa olla, että normaali toksiininvapautus edellyttää nimenomaan tehokasta itiöitymistä. Tarvitaan kuitenkin jatkotutkimuksia, jotta saadaan entistä laajempi kuva bakteerien toksiininvapautusmekanismeista ja geneettisestä säätelystä. orfX2-geenin tehtävää ei tunneta, mutta epäillään, että se joko säätelee toksiinintuotantoa tai vastaa toksiinin rakenteellisen kompleksin proteiiniosan muodostumisesta. Tutkimuksessa havaittiin, että orfX2-geenin deleetio vaikutti sekä bakteerin itiöintiin että toksiinintuotantoon negatiivisesti. Lisäksi bakteerisolujen pidentynyt rakenne viittaa siihen, että bakteereilla oli jakaantumisongelmia. Tutkimuksen ∆orfX2-kannan deleetio oli kuitenkin tapahtunut epätäydellisesti, joten tästä johtuvat polarisaatiovaikutukset voivat olla mahdollisia. ∆amyE toimi tutkimuksessa kontrollikantana. amyE-geeni vaikuttaa tärkkelyksen pilkontakykyyn, joten deleetion ei oleteta vaikuttavan bakteerin toksiinintuotantoon tai itiöitymiseen. Tutkimustulokset olivat hypoteesin mukaisia.

Clostridium botulinum on gram-positiivinen itiöllinen anaerobinen sauvabakteeri. Epäsuotuisissa kasvuolosuhteissa bakteeri tuottaa lämpökestävän itiön. Bakteerin itiöitä esiintyy yleisesti maaperässä ja vesistöjen sedimenteissä. Clostridium botulinumin vegetatiivisten solujen tuottama toksiini on yksi vahvimmista myrkyistä ja se voi sairastuttaa sekä ihmisiä että eläimiä. Hevonen on erittäin herkkä botulinumtoksiinille. Maailmalla on raportoitu useita tapauksia, joissa pilaantunutta rehua syöneet hevoset ovat sairastuneet ja kuolleet myrkyn aiheuttamiin halvausoireisiin. Myös Suomessa on raportoitu botulismiepäilyjä, jotka ovat liittyneet pilaantuneen säilörehun syöttämiseen. Tässä tutkimuksessa selvitettiin C. botulinum tyyppien A, B, E ja F itiöiden mahdollista esiintymistä hevosen ulosteessa laidunkaudella. Työni liittyy osana tutkimukseen, jossa selvitetään C. botulinumin itiöiden esiintyvyyttä hunajassa. Mehiläisten tiedetään käyttävän vettä pesän lämmönsäätelyyn ja omaksi ravinnokseen. Tarvitsemansa veden mehiläiset hakevat lantaloista ja lantakasoista ja näin ollen on mahdollista, että hevosen uloste voisi toimia mahdollisena kontaminaatiolähteenä. Suomessa ei ole aikaisemmin tutkittu C. botulinumin itiöiden esiintymistä hevosen ulosteessa. Näytteet kerättiin eläinlääkäreiden ja eläinlääketieteen kandidaattien avustuksella sadalta hevoselta eri puolilta Suomea. Näytteenottotiloilla eläinlääkäri täytti hevosen omistajan tai tallinpitäjän avustuksella kyselykaavakkeen, jonka avulla selvitettiin mm. hevosten ruokintaa, vedensaantia ja laidunolosuhteita. C. botulinumin detektio tehtiin rikastuksen jälkeen multiplex-PCR –menetelmällä. Itiöiden määrä määritettiin MPN (Most Probable Number) –menetelmää käyttäen. Näytteistä punnittiin 1 g:n erissä kymmenen putken sarjat, joista positiivisen tuloksen antaneiden putkien lukumäärästä MPN-luku laskettiin. Käytetyllä menetelmällä hevosen ulostenäytteistä havaittiin C. botulinumin suhteen positiivisiksi 16 (16%) näytettä. Kaikki positiiviset näytteet sisälsivät tyypin B itiöitä. Tulos on sopusoinnussa elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksella meneillään olevan tutkimuksen kanssa, jossa C. botulinum tyyppiä B todettiin esiintyvän Suomen maaperässä. Ulostenäytteistä löydettyjen itiöiden määrä vaihteli 11-69 kpl itiöitä/100 g näytettä keskiarvon ollessa 28 itiötä/100 g näytettä. Kyselytutkimuksen aineisto analysoitiin c2 –testin avulla. Kysyttyjen muuttujien suhteen ei havaittu tilastollisesti merkittäviä eroja positiivisten ja negatiivisten hevosten välillä (p>0,05). Tämän tutkimuksen perusteella hevosen uloste voi toimia mahdollisena kontaminaatiolähteenä hunajassa esiintyville C. botulinumin itiöille.

Clostridium botulinum on itiöitä muodostava gram-positiivinen sauvamainen anaerobibakteeri, jota tavataan yleisesti maaperässä ja vesistöissä ympäri maailmaa. Maaperästä ja vesistöistä se siirtyy helposti itiöidensä avulla kasveihin ja kaloihin, sekä myös muihin ihmisten käyttämiin elintarvikkeisiin. C. botulinum tuottaa lisääntyessään maailman myrkyllisimpänä aineena tunnettua neurotoksiinia, jota kutsutaan botulinumtoksiiniksi. C. botulinum jaetaan serotyyppeihin A, B, C, D, E, F ja G, joista tyypit A, B, E ja F ovat tavallisimpia humaanibotulismin aiheuttajia. Botulismia tavataan ihmisillä neljässä eri muodossa: klassinen ruokamyrkytysbotulismi, haavabotulismi, imeväisbotulismi sekä suolistobotulismi. Imeväisbotulismi on alle vuoden ikäisillä pikkulapsilla esiintyvä sairaus, joka aiheutuu C. botulinum –itiöiden germinoituessa ja tuottaessa toksiinia lapsen suolistossa. Sairaudella on erilaisia vakavuusasteita lievistä oireista äkkikuolemaan (kätkytkuolema) ilman edeltäviä oireita. Hunaja on toistaiseksi todettu ainoaksi vehikkelielintarvikkeeksi imeväisbotulismitapauksissa. C. botulinumin prevalenssia hunajassa on tutkittu useissa eri maissa ja itiöitä on todettu esiintyvän noin 0-20 %:ssa tutkituista näytteistä. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää C. botulinum –itiöiden prevalenssia ruotsalaisessa hunajassa, sekä arvioida saadun tuloksen perusteella sisältääkö ruotsalaisen hunajan syöttäminen pikkulapsille imeväisbotulismiriskin. Hunajanäytteet (61 kpl) esikäsiteltiin ja tutkittiin multiplex-PCR-menetelmällä ja pyrittiin osoittamaan näytteissä mahdollisesti esiintyvä C. botulinum -serotyypin A, B, E tai F neurotoksiinigeeni. Tutkituista hunajanäytteistä löytyi vain yksi positiivinen näyte, jolloin C. botulinum –itiöiden prevalenssi ruotsalaisessa hunajassa on tämän tutkimuksen mukaan 2 %. Tulos vastaa suuruusluokaltaan muissa pohjoismaissa saatuja tuloksia. Löydetty C. botulinum –organismi oli serotyyppiä E. Näytteet olivat peräisin lingotusta hunajasta, joten suoraan mehiläispesistä tai kennostoista otetuissa näytteissä prevalenssi olisi saattanut osoittautua suuremmaksi. Saadun tuloksen perusteella voidaan siis ruotsalaisen hunajan syöttämisen alle vuoden ikäisille lapsille katsoa sisältävän imeväisbotulismiriskin. Alhaisen prevalenssin vuoksi riski on kuitenkin vähäinen.

Clostridium botulinum on yleinen bakteeri maaperässä ja vesistöissä. Se kasvaa anaerobisesti, eli se on erittäin potentiaalinen pilaaja säilykkeissä ja tyhjiöpakatuissa tuotteissa. C .botulinumin eristäminen näytteistä on aikaa vievää runsaan sekakasvun takia. Proteolyyttisten C. botulinumin -kantojen eristykseen on olemassa selektiivinen elatusaine, mutta ongelmaksi jää nonproteolyyttisten kantojen, kuten E-tyyppisten kantojen eristäminen, koska osa näistä kannoista ei kykene kasvamaan tällä elatusaineella. Tämän tutkimuksen tarkoituksena olikin kehittää C. botulinum tyyppi E:lle selektiivinen elatusaine, joka estäisi mahdollisimman monien näytteissä esiintyvien kontaminanttien kasvua. Tutkimuksessa käytettiin neurotoksiinia tuottavia C botulinum tyyppi E -kantoja ja negatiivisina vertailukantoina elintarvike- ja ympäristönäytteistä eristettyjä neurotoksiinia tuottamattomia pesäkemorfologialtaan C. botulinum tyyppi E:tä muistuttavia klostridikantoja. Kantojen neurotoksiinituotanto osoitettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Lääkeaineherkkyysmääritykset tehtiin agardiffunsiotekniikalla ja tarkoituksena oli löytää antibiootti, jolle C. botulinum tyyppi E olisi lähes resistentti, mutta jolle toksiinia tuottamattomat kannat puolestaan olisivat herkkiä. Lääkeaineherkkyysmäärityksissä todettiin C. botulinum tyyppi E:n kestävän toksiinia tuottamattomia kantoja paremmin seuravia antibiootteja: atstreonaami, kloksasilliini, kefiksiimi, kefotaksiimi, metisilliini, mesillinaami, penisilliini ja trimetopriimisulfa. Selektiiviseksi aineeksi valittiin kolmannen polven kefalosporiini, kefotaksiimi, jolle C. botulinum tyyppi E:n kannat olivat melko resistenttejä, mutta neurotoksiinia tuottamattomat negatiiviset vertailukannat olivat huomattavasti herkempiä. Kefotaksiimia lisättiin eri konsentraatioilla C. botulinumin eristyksessä käytettyyn elatusaineeseen (EYA = egg yolk agar). Kefotaksiimikonsentraatiot 5 ja 10 mg/1 agaria eivät sanottavasti heikentäneet C. botulinum tyyppi E:n kasvua, mutta estivät melko tehokkaasti kontaminanttien kasvua. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella olisi suositeltavaa käyttää C. botulinum tyyppi E:n eristämisessä selektiivistä kefotaksiimi agaria, jossa kefotaksiimikonsentraatio olisi 5 tai 10 mg/l agaria, pelkän EYA:n tilalla.

Clostridium botulinum on anaerobinen, itiöitä tuottava, gram-positiivinen bakteeri, joka tuottaa vahvinta tunnettua luonnollista myrkkyä, botulinumneurotoksiinia. Se aiheuttaa ihmisessä ja eläimissä harvinaista botulismia, joka on vakava, mahdollisesti kuolemaan johtava hermoston halvaustila. Botulismia tavataan säilöttyjen ja pakattujen elintarvikkeiden välityksellä leviävänä klassisena ruokamyrkytyksenä sekä suolistokolonisaationa imeväisikäisillä ja haavainfektiona ruiskuhuumeiden käyttäjillä. C. botulinumin luontaisesta elinympäristöstä ja ravinnosta tiedetään vähän. Samankaltaisen itiöllisen bakteerin, Bacillus subtiliksen, on todistettu käyttävän muita bakteereita ravinnokseen, mikä herättää kysymyksen myös C. botulinumin ravinnonhankinnasta ja samalla neurotoksiinituotannon merkityksestä bakteerin biologiassa. On kiinnostava kysymys, voisiko myrkyllä olla rooli ravinnonhankinnassa. Tutkimuksessa selvitettiin, käyttääkö C. botulinum ravinnokseen erilaisia gram-positiivisista ja -negatiivisista bakteereista tai luonnossa bakteerin elinympäristössä mahdollisesti esiintyvistä selkärangattomista peräisin olevia komponentteja, ja vaikuttavatko nämä substraatit C. botulinumin itiöitymiseen tai hermomyrkyntuotantoon. Substraatteina tutkittiin muun muassa kuollutta bakteerisolumassaa, bakteerien soluseinässä ja hyönteisten tai äyriäisten kuoressa esiintyvää kitiiniä sekä sen rakenneainetta, N-asetyyli-D-glukosamiinia (GlcNAc), sekä positiivisena kontrollina glukoosia. Tarkoitus oli kerryttää tietämystä C. botulinumin mahdollisesta luontaisesta elinympäristöstä ja ravinnosta ja sitä kautta etsiä yhteyksiä hermomyrkyntuottoon tai itiöitymiseen. Testikantana käytettiin C. botulinum ryhmän II Beluga Ei -kantaa, joka tuottaa rakenteellisesti autenttista mutta biologisesti inaktiivista toksiinia (toksoidi). Bakteerit kasvatettiin anaerobisissa olosuhteissa vähäravinteisessa kasvatusliemessä, johon lisättiin testattavia substraatteja. Negatiiviseen kontrollielatusaineeseen ei lisätty substraattia. Bakteerikasvua seurattiin mittaamalla kasvuston optista tiheyttä spektrofotometrilla sekä seuraamalla elävien bakteerien ja itiöiden määrää ja pH:ta kasvustossa. Tuotetun hermomyrkyn määrää seurattiin käyttämällä immunologista testiä (sandwich-ELISA). Bakteerien solumorfologiaa tarkasteltiin faasikontrastimikroskopian avulla. Tutkimuksessa selvisi, että bakteeriperäiset substraatit elatusaineessa lisäsivät C. botulinumin toksiinituotantoa elatusaineessa. Tämä saattaisi mahdollisesti liittyä ravinnonhankintaan, mikä viittaisi C. botulinumin kykyyn hyödyntää muita bakteereja ravinnokseen. Eri lajin bakteerimassa elatusaineessa lisäsi toksiinituotantoa enemmän kuin saman lajin, mikä voisi viitata C. botulinumin suosivan saaliskäyttäytymistä kannibalismin sijaan. Kaikkein suurimmat toksiinipitoisuudet mitattiin GlcNAc:a ja glukoosia sisältävistä elatusaineista. Botulinumneurotoksiinin hyöty bakteerille ja sen rooli ravinnonhankinnassa vaativat lisätutkimuksia. Bakteeriperäiset substraatit elatusaineessa lisäsivät C. botulinumin kasvua ja itiöitymistä. Sen sijaan GlcNAc ja glukoosi elatusaineessa laskivat elatusaineiden pH:ta huomattavasti, mikä johti itiöitymisen vähenemiseen. Tutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää elintarviketurvallisuustutkimuksissa ja pyrkiä siten etsimään keinoja C. botulinumin toksiinituotannon hallitsemiseen elintarvikkeissa.

Clostridium botulinum is an obligatory anaerobic, gram-positive and spore-forming food-borne pathogen. It produces one of the most toxic substances known, botulinum neurotoxin. Botulinum toxin causes a rare but life-threatening illness called botulism. The significance of botulism may grow in the future with the development of the modern food industry. C. botulinum strains form four physiologically distinct groups (I-IV). The four groups are diverse, as for example the group I spores have a high heat resistance, while group II strains are capable of growing in refridgerated temperatures. Toxins from the groups I and II are human pathogens, while toxins produced by group III strains are pathogenic only to animals. There are seven distinct serotypes of botulinum toxins, and these are marked with letters A-G. Inhibition of neurotransmitter acetylcholine release caused by botulinum toxin causes paralysis. All bacteria have sigma factors, which are an important part of transcription initiation mechanism. Sigma factors are components of the RNA polymerase holoenzymes. These are involved in recognizing specific promoters, and by binding to different promoters they enable the initiation of transcription. Bacteria have many different sigma factors that are divided into two classes: in first class there are house-keeping σ70-factors and stress-activated alternative sigma factors and in the second class σ54-factors, which are involved in nitrogen metabolism and stress tolerance. Only little research has been done on C. botulinum sigma factors and there is, for example, no knowledge of their heat and cold resistance. In this research we studied the importance of σ54-factor in the colony morphology, metabolism and heat and cold resistance of C. botulinum ATCC 3502. A deletion mutant for the gene CBO0224 of C. botulinum was constructed with ClosTron technique, in which a target-specified group II intron is inserted into the genome. After activation, the intron interrupts the gene and inhibits transcription. The mutant strain was compared to the wild type by growing it on blood and egg yolk agar plates, on which it grew slower and the colonies were smaller. The metabolism of the mutant was studied with API-test, in which the mutant did not show any sign of fermentation of glucose, maltose, salicin or trehalose, or hydrolysis of esculin or utilization of urea. The mutant was also compared to the wild type by growing both strains at different temperatures, at 15°C and 20°C, at the optimum temperature of 37°C and at 45°C. The mutant grew slower than the wild type at all studied temperatures. The σ54-factor of C. botulinum strain ATCC 3502 has a clearly influence on the bacterium's capability of growing both in an optimal and a stressful environment. In this research the first genetically modified strain of the σ54-factor of C. botulinum ATCC 3502 strain was constructed to produce information on the sigma factor's importance to the metabolism and stress resistance of the bacterium.