Browsing by Title

Kirjallisuuskatsauksessa käydään läpi erilaisia menetelmiä C3-substituoitujen indolien synteeseihin 2-alkenyylianiliinityyppisistä lähtöaineista, joiden bentsyylinen asema oli substituoitu. Erityistä huomiota kiinnitetään menetelmiin, joiden reaktiomekanismeiksi ehdotettiin radikaalimekanismeja. Myös näitä ehdotettuja radikaalimekanismeja esitellään tutkielmassa. Kokeellisessa työssä tutkittiin C3-subsituoitujen indolien hapettavaa synteesiä hiilikatalyytin avulla. Lähtöaineina käytettiin bentsyylisesti aryylisubstituoituja 2-alkenyylianiliinijohdannaisia. Joidenkin lähtöaineiden typpeen oli kiinnitetty metoksipyridiini, jonka kiinnitystä varten kehitettiin Buchwald-katalyysi. Hiilikatalyysit tuottivat hyviä saantoja. Korkea elektronitiheys, etenkin aniliinin bentseenirenkaan ja/tai typen aromaattisen substituentin korkea elektronitiheys, oli eduksi. Reaktion mekanismin ehdotetaan alkavan hapettumisella radikaalikationiksi, ja näitä hapetuspotentiaaleja laskettiin aiemmin raportoidun menetelmän mukaisesti. Mikäli indolin 5-renkaan substituutiot (N1, C2, C3) olivat tarpeeksi samankaltaisia, korkea elektronitiheys, matala hapetuspotentiaali ja hyvä saanto korreloivat. Indolin 5-renkaan substituutio on kuitenkin merkittävämpi tekijä kuin hapetuspotentiaali ja/tai korkea elektronitiheys. Pyridiini typen suojaryhmänä toimi katalyysissä ja se onnistuttiin poistamaan helposti. Metoksipyridiini toimi katalyysissä hyvin, mutta sen kvantitatiivinen poistaminen ei onnistunut.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are derived from adult differentiated somatic cells and reprogrammed to an embryonic-like state. Pluripotent stem cells can be differentiated into almost any somatic cell type by using directed differentiation methods, but the differentiation efficiency often varies depending on the cell type. hiPSCs and cells differentiated from them can be used as a disease model carrying the patient’s phenotype and genotype. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive motor neuron disease where both upper and lower motor neurons degenerate, leading to paralysis. There is no curative treatment for ALS, and it leads to the death of the patient in 3 to 5 years on average from the first symptoms. The most common genetic cause of familial ALS is a hexanucleotide repeat expansion in C9orf72-gene. ALS pathology is strongly linked to endoplasmic reticulum (ER) stress, which affects cell homeostasis and proteostasis, and leads to apoptosis when prolonged. The primary aim of this research is to characterize the differentiation of four hiPSCs lines towards lower motor neurons and to study the neuroprotective effects of cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and CDNF-derived peptide on ER stress and cell viability. This experiment used two control cell lines from two healthy donors and two patient cell lines from two different ALS patients carrying the C9orf72-mutation. To evaluate the efficiency of the differentiation towards motor neurons, molecular markers for pluripotent and neural progenitor cells as well as for maturated motor neurons were analyzed. Relative gene expression levels were measured from weekly time points with qPCR. Immunocytochemical (ICC) antibody staining was performed during differentiation. Endogenic CDNF levels were analyzed from differentiating cells at weekly time points and the effect of CDNF on Thapsigargin (TG) -induced ER stress in motor neurons was analyzed. In addition, cell viability was analyzed in TG-CDNF treatment. All pluripotent and progenitor markers were downregulated in differentiated cells, and the expression of the mature motor neuron markers was upregulated. Mature motor neuron markers were also expressed at the protein level. The endogenous CDNF levels were highest at the progenitor cell stage. The ER stress response was upregulated in TG-treated cells, and there were no differences between treatments against ER stress. Furthermore, TG and growth factor treatments differentially affected the viability of the control and patient cell lines. Treatment decreased viability in control cell lines and increased viability in patient cell lines. Pluripotent stem cells were successfully differentiated toward motor neurons. The differentiation was performed twice, and the results were similar on both individual biological repeats. Analysis of endogenous CDNF expression levels was performed for the first time on hiPSCs lines. In this study, CDNF or its derivate didn’t reduce ER stress but it influenced cell viability, especially in patient cell lines with growth factor treatment. In the future, TG-treatment could be optimized regarding timing and growth factor treatment, or the toxin could be changed to another ER-stress inducing toxin. In addition, the C9orf72 pathology should be identified in order to use differentiated motor neurons as a pre-clinical disease model.

In analysis of structural information for transmembrane (TM) proteins it is ideal to work with a three-dimensional (3D) structure. This is not always possible as determining an accurate 3D structure can be challenging and expensive as pursuing one can take large amounts of time. Sequence analysis is often used as a surrogate to determine a subset of information regarding secondary and tertiary protein structure given the primary structure (an amino acid sequence). Using Equilibrative Nucleoside Transporter member 1 (ENT1) as a model, the objective of predicting secondary and tertiary structure given primary structure is attempted through computational (in silico) methods. The in silico methods include the use of a pipeline of programs spanning both custom made and ready built software. A set of 2034 homologous protein sequences are first obtained from the initial human ENT1 (hENT1) sequence through a BLASTp. This sequence information is then processed to acquire information on variation, conservation, and hydrophobicity through topology prediction, hydropathic moment plots and variation moment plots. Comparing these results with data acquired from Glycerol-3-Phosphate Transporter (GlpT), a protein with a known 3D structure of 3.3 Angstrom resolution is done to assess evidence of evolutionary origin. This in turn allows estimation on the reliability of predictions to be made on aspects of the secondary and tertiary structure for hENT1. The results show that within predicted TM alpha helical regions that there is some level of correlation between the variation of the amino acids within the alpha helical TM region and its orientation towards the membrane. This can be further refined by gathering statistics on other known proteins with a 3D structure for their relationships in TM regions to hydrophobicity and variability. This will aid in secondary and tertiary structure predictions of other TM proteins given further refinement and additional data. In addition, the sequence conservation information obtained should prove to be robust and allow for a large number of sequences to be analyzed to determine conservation of amino acids given a reference protein. Ideally this information will provide aid in determining interesting amino acids for experiments to be done on hENT1.

Polygenic risk scores (PRSs) estimate the genetic risk of an individual for a certain polygenic disease trait by summing up the effects of multiple variants across the genome affecting the disease risk. Currently, polygenic risk scores (PRSs) are calculated from imputed array genotyping data which is inexpensive to produce use and has standard procedures and pipelines available. However, genotyping arrays are prone to ascertainment bias, which can also lead to biased PRS results in some populations. If PRSs are utilized in healthcare for screening rare diseases, usage of whole-genome sequencing (WGS) instead of array genotyping is desirable, because also individual samples can be analyzed easily. While high-coverage WGS is still significantly more expensive than array genotyping, low-coverage whole genome sequencing (lcWGS) with imputation has been proposed as an alternative for genotyping arrays. In this project, the utility of imputed low-coverage whole-genome sequencing (lcWGS) data in PRS estimation compared to genotyping array data and the impact of the choice of imputation tool for lcWGS data was studied. Down-sampled WGS data with six different low coverages (0.1x-2x) was used to represent lcWGS data. Two different pipelines were used in genotype imputation and haplotype phasing: in the first one, pre-phasing and imputation were performed directly for the genotype likelihoods (GLs) calculated from the down-sampled data, whereas in the second one, the GLs were converted to genotype calls before imputation and phasing. In both pipelines, PRS for 27 disease phenotypes were calculated from the imputed and phased lcWGS data. Imputation and PRS calculation accuracy of the two pipelines were calculated in relation to both genotyping array and high-coverage whole-genome sequencing (hcWGS) data. In both pipelines, imputation and PRS calculation accuracy increased when the down-sampled coverage increased. The second imputation and phasing pipeline lead to better results in both imputation and PRS calculation accuracy. Some differences in PRS accuracy between different phenotypes were also detected. The results show similar patterns to what is seen in other similar publications. However, not quite as high imputation and PRS accuracy as seen in earlier studies could be attained, but possible limitations leading to lower accuracy could be identified. The results also emphasize the importance of choosing suitable imputation and phasing methods for lcWGS data and suggest that methods and pipelines designed particularly for lcWGS should be developed and published.

Tutkin tässä työssä mahdollisuutta laskea paineistetussa vesiputkistossa virranneen veden määrää muinaisessa Pompejissa säilyneiden arkeologisten jäännösten perusteella ja teen huomioita Pompejin vesijärjestelmän eri osien toiminnasta. Kuvailen soveltuvin osin antiikin kirjallisia alkuperäislähteitä sekä modernia tutkimushistoriaa. Teen yleiskatsauksen vesijärjestelmään Pompejissa ja esitän omia tulkintojani järjestelmän joidenkin osien toiminnasta. Näitä osia ovat päävesitorni, toissijaiset vesitornit ja lyijystä tehdyt vesiputkistot. Esitän perustelut virtauslaskujen tekemiseen sopivien testikohteiden valinnalle. Testikohteita ovat korttelit V1, IX 3 ja kaksi taloa korttelissa VII 4. Esitän yleisen kuvauksen kustakin korttelista ja yksityiskohtaisen kuvauksen taloista ja huoneista, joissa on vesiputkia. Kuvailen myös lyhyesti testikohteisiin liittyvät toissijaiset vesitornit, joita ovat vesitornit numero yksi, kaksi, kolme ja seitsemän. Kuvaan yksityiskohtaisesti mahdollisia putkilinjoja toissijaisista vesitorneista testikohteisiin ja esitän perustelut putkilinjojen valinnalle. Kuvailen lyhyesti fysikaalisia virtausopin kaavoja ja ainoastaan putkivirtauslaskelmien kannalta katsottuna. Esitän myös kaavan neljännen asteen yhtälölle, jonka kuvaaja, kun se on piirretty koordinaatistoon muistuttaa roomalaisten vesiputkien muotoa ja esitän syyt miksi tätä yhtälöä voi käyttää roomalaisten vesiputkien yhteydessä. Esitän kuvauksen putkivirtauslaskelmien kulusta ja esitän tuloksia edustavin osin. Lopuksi puhun laskelmiin liittyvistä ongelmista ja esitä suosituksia mahdollisia jatkotutkimuksia varten.

The feasibility of quantitatively measuring ultrasound in air with a Schlieren arrangement has been demonstrated before, but previous work demonstrating calibration of the system combined with computation to yield the 3D pressure field does not exist. The present work demonstrates the feasibility of this both in theory and practice, and characterizes the setup used to gain the results. Elementary ray optical and Schlieren theory is exhibited to support the claims. Derivation of ray optical equations related to quantitative Schlieren measurements are shown step by step to help understand the basics. A numerical example based on the theoretical results is then displayed: Synthetic Schlieren images are computed for a theoretical ultrasonic field using direct numerical integration, then the ultrasonic field is recovered from the Synthetic Schlieren images using the inverse Abel transform. Accuracy of the inverse transform is evaluated in presence of synthetic noise. The Schlieren arrangement, including the optics, optomechanics, and electronics, to produce the results is explained along with the stroboscopic use of the light source to freeze ultrasound in the photographs. Postprocessing methods such as background subtraction and median and Gaussian filtering are used. The repeatability and uncertainty of the calibration is examined by performing repeated calibration while translating or rotating the calibration targets. The ultrasound fields emitted by three transducers (100 kHz, 175 kHz, and 300 kHz) when driven by 5 cycle sine bursts at 400 Vpp are measured at two different points in time. The measured 3D pressure fields measured for each transducer are shown along with a line profile near the acoustic axis. Pressure amplitudes range near 1 kPa, which is near the acoustic pressure, are seen. Nonlinearity is seen in the waveforms as expected for such high pressures. Noise estimates from the numerical example suggest that the pressure amplitudes have an uncertainty of 10% due to noise in the photographs. Calibration experiments suggest that additional uncertainty of about 2% per degree of freedom (Z, X, rotation) is to be expected unless especial care is taken. The worst-case uncertainty is estimated to be 18%. Limitations and advantages of the method are discussed. As Schlieren is a non-contacting method it is advantageous over microphone measurements, which may affect the field they are measuring. As every photograph measures the whole field, no scanning of the measurement device is required, such as with a microphone or with an LDV. Suggestions to improve the measurement setup are provided.

Calsyntenin-3 is a type I transmembrane protein, that is mainly expressed on the post-synaptic cell membranes. It belongs to the calsyntenin family that is part of the cadherin superfamily. Calsyntenin-3 consists of a cytosolic C-terminal region, a transmembrane domain and an extracellular N-terminal part, that consists of a laminin G-like domain (LNS) and two cadherin domains (CAD). Calsyntenin-3 is mainly expressed in the brain, but it can also be found in the heart, liver, pancreas, lung, skeletal muscle and placenta. Calsyntenin-3 has an effect on neurogenesis by affecting the development of excitatory and inhibitory synapses. It might also play a role in Alzheimer’s disease, as it has been found to be able to bind β-amyloid peptide, that is known to play a key role in the development of Alzheimer’s disease. Calsyntenin-3 acts as a synaptic adhesion protein, that binds to the post-synaptic neurexins with its extracellular region. However, the previous studies have contradicting results regarding the calsyntenin-3 domains that mediate the interaction between the calsyntenin-3 and neurexins. There is also disagreement whether calsyntenin-3 binds neurexin-α, neurexin-β or both. Because of these discrepancies, the aim of this master’s thesis study was to produce the calsyntenin-3 ectodomain constructs that contained either the two CAD domains, the LNS domain or all three domains, using baculovirus mediated protein production in insect cell cultures. These purified protein constructs were meant to be used for the determination of the binding domains. Unfortunately, only the purification of the calsyntenin-3 LNS domain was successful and the purification of the constructs, containing the CAD domains, was unsuccessful. A SEC-MALLS experiment, that was performed for the calsyntenin-3 LNS domain, revealed that it forms dimers in a solution, which is consistent with experiments performed with the LNS domain of human sex hormone‐binding globulin. The second aim of this master’s thesis study was to express the calsyntenin-3 ectodomain constructs on the surface of HEK293T cells and to test the binding between calsyntenin-3 and neurexins in a cell surface binding assay. The results of the cell surface binding assay indicated that the binding is mediated by the calsyntenin-3 CAD domains and that calsyntenin-3 binds to neurexin-α, but the binding to neurexin-β was not detected. However, the results from the cell surface binding assay were conflicting: the binding between the calsyntenin-3 full ectodomain construct and neurexin-α was not detected, but the binding was detected between calsyntenin-3 CAD ectodomain construct and neurexin-α. Therefore, the cell surface binding assay cannot be considered entirely reliable and should be repeated before making further conclusions.

Väestönkasvu lisää tarvetta öljykasvien tuotannolle ihmisravinnoksi ja biopolttoaineeksi. Öljynpuristamisesta saatavat sivutuotteet, kuten rouheet ja puristeet sisältävät hyvälaatuista valkuaista eläinten ruokintaan. Camelina (Camelina sativa) ja hamppu (Cannabis sativa) ovat potentiaalisia vaihtoehtoja nautojen valkuaisruokinnassa. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää camelina- ja hamppupuristeen vaikutusta in vitro pötsikäymiseen eri karkearehukäsittelyillä. Karkearehuina käytettiin lämpökuivattua nurmi-, puna-apila- ja maissisäilörehua ja väkirehuna ohraa. Kontrollina toimivat rypsipuriste ja käsittelyt, jotka eivät sisältäneet täydennysvalkuaisrehua eli koostuivat ainoastaan karkearehusta ja ohrasta. Kaikkien käsittelyiden karkearehu:väkirehusuhde oli 1:1 kuiva-aineessa. Valkuaislisättömien käsittelyiden raakavalkuaispitoisuudet vaihtelivat 95–140 g/kg ka välillä riippuen käytetyn karkearehun raakavalkuaispitoisuudesta. Valkuaiskäsittelyissä raakavalkuaispitoisuudeksi tuli 170 g/kg ka. Inkubaatiopulloihin punnittiin rehuja yhteensä 3,5 g ka. Käsittelyitä oli 12 kpl ja lisäksi jokaisessa ajossa oli 2 kpl blancoja, joihin ei punnittu rehuja. Ajoja tehtiin neljä. Jokainen ajo kesti 30 h ja näytteitä otettiin 1, 4, 8, 12, 24 ja 30 h kuluttua inkubaation aloituksesta. Näytteistä määritettiin haihtuvat rasvahapot (VFA), ammoniumtyppi ja pH. Analyysituloksista laskettiin haihtuvien rasvahappojen moolisuhteet. Tutkittavista rehuista analysoitiin lisäksi sekundäärinen kuiva-aine, tuhka, tuhkaton neutraalidetergenttikuitu (NDF), raakavalkuainen ja kokonaisrasva. Valkuaisrehuista analysoitiin typpifraktiot (A, B1, B2, B3 ja C). Rypsi-, camelina- ja hamppupuristeen raakavalkuaispitoisuudet olivat 332, 367 ja 286 g/kg ka vastaavasti. Hypoteesin vastaisesti valkuaisrehun lisääminen ei lisännyt VFA:n kokonaismäärää ja ammoniumtypen muodostusta. Hypoteesin mukaisesti valkuaisrehun lähde vaikutti pötsikäymisen voimakkuuteen. Camelina- ja rypsipuristetta sisältävät käsittelyt vastasivat toisiaan VFA:n kokonaismäärässä (P>0,05) hypoteesin mukaisesti. Camelina lisäsi kuitenkin propionihapon kokonaismäärää (P<0,05) ja mooliosuutta (P<0,01) verrattuna rypsiin sekä pienensi voihapon mooliosuutta verrattuna rypsiin (P<0,01). Hamppupuristeella VFA:n kokonaismäärä oli pienempi kuin camelinapuristeella (P<0,05) ja suuntaa antavasti pienempi kuin rypsipuristeella (P=0,063). Hamppupuriste vähensi propionihapon kokonaismäärää ja lisäsi etikkahapon mooliosuutta verrattuna rypsiin (P<0,001 ja P<0,01, vastaavasti) ja camelinaan (P<0,001 ja P<0,01, vastaavasti). Karkearehun lähde vaikutti VFA:n kokonaismääriin ja moolisuhteisiin. Puna-apilasäilörehua sisältävissä käsittelyissä VFA:n kokonaismäärät olivat suuremmat kuin maissisäilörehua sisältävissä käsittelyissä (P<0,05). Puna-apilasäilörehukäsittely lisäsi etikkahapon ja propionihapon kokonaismääriä verrattuna nurmisäilörehukäsittelyihin (P<0,05 ja P<0,01 vastaavasti) ja maissisäilörehukäsittelyihin (P<0,01 ja P<0,05, vastaavasti). Tulosten perusteella camelinapuristeen raakavalkuaispitoisuus oli rypsiä suurempi ja näiden VFA:n kokonaismäärät ja typpifraktiot vastasivat toisiaan. Camelina voisi siis vastata rypsiä nautojen valkuaisruokinnassa, mutta hampun valkuaisarvo on mahdollisesti näitä alhaisempi VFA:n kokonaismäärän ja moolisuhteiden perusteella. Hamppupuristeen suurempi NDF-kuidun määrä voisi selittää camelina- ja rypsipuristekäsittelyitä suuremman etikkahapon mooliosuuden. Karkearehun lähde vaikutti pötsikäymiseen ja puna-apila lisäsi VFA:n kokonaismäärää verrattuna nurmi- ja maissisäilörehuun, jolla voi olla positiivisia vaikutuksia energiansaantiin ja maitotuotokseen.

Nykyään kuluttajat ovat entistä kiinnostuneempia elintarvikkeiden laadusta ja niiden terveellisyydestä. Eläinperäisten tuotteiden koostumukseen voidaan vaikuttaa eläimille syötettävän rehun kautta. Suomessa täydennysvalkuaisrehun omavaraisuusaste on heikko, 20,9 % vuonna 2021, joten siihen kaivataan uusia vaihtoehtoja rypsin ja rapsin rinnalle. Tässä tutkielmassa tutkittiin camelinan ja hampun soveltuvuutta kotieläinten ruokintaan täydennysvalkuaisrehuna, koska niiden siemenet sisältävät runsaasti valkuaista ja rasvaa. Aineiston siemennäytteet kerättiin camelinaa (n=5) ja hamppua (n=20) viljelyttäviltä yrityksiltä (Janakkalan piensiemen ja TransFarm), näytteet olivat kasvukaudelta 2021. Hampusta analysoitavat siemennäytteet valittiin siten, että niissä on mukana sekä suuren sadon (>600 kg/ha) että pienen sadon (<400 kg/ha) näytteitä ja että ne ovat maantieteellisesti mahdollisimman edustavia. Näytteistä analysoitiin peruskoostumus; kuiva-aine, kokonaisrasva, raakavalkuainen, tuhka ja neutraalidetergenttikuitu (NDF). Lisäksi haitta-aineista analysoitiin glukosinolaatit camelinasta ja trypsiini-inhibiittorit camelinasta ja hampusta. Hampusta kerättiin viljelytietoja kyselyllä, jonka TransFarm oy toteutti sopimusviljelijöilleen kasvukausilla 2021 (n= 61 kpl) ja 2022 (n=59 kpl), vastauksia saatiin yhteensä 120 kpl. Tilastollisia yhteyksiä hampusta selvitettiin SAS-tilasto ohjelmalla ristiintaulukoinnin, varianssianalyysin ja korrelaatioanalyysin avulla. Tilastoanalyyseja ei tehty camelinan koostumuksesta havaintojen pienestä määrästä johtuen. Tulosten mukaan hampun satotasoon vaikuttivat kasvuston korkeus, puintikosteus, taimettuneiden yksilöiden määrä ja tuotantomuoto. Mitä korkeampi kasvusto (P<0,001) ja mitä suurempi puintikosteus (P<0,05), sitä suurempi osuus havainnoista sijoittui suurimpaan satotasoluokkaan (>600 kg/ha). Lisäksi suuntaa-antavasti (P<0,10) taimettuneiden yksilöiden määrän (kpl/m2 ) lisääntyessä suurempi osuus havainnoista sijoittui suurimpaan satotasoluokkaan. Hypoteesin vastaisesti typpilannoitustasolla ja maan fosforiluokalla ei havaittu olevan yhteyttä hampun satotasoon (P>0,10). Luomutuotannossa suurempi osuus havainnoista sijoittui pienimpään satotasoluokkaan (P<0,05) ja suuntaa-antavasti matalampaan kasvuston korkeusluokkaan (P<0,10) kuin tavanomaisessa tuotannossa. Ristiintaulukoinnissa (n=120) ei havaittu yhteyttä tuotantomuodon ja kasvuajan välillä, varianssianalyysissä (n=20) luomutuotannossa oli lyhyempi kasvuaika kuin tavanomaisessa tuotannossa (P<0,05) Kokonaisrasvapitoisuudet olivat camelinan siemenissä 375– 410 g/kg ka, hampun siemenissä rasvapitoisuudet olivat suurempia pienemmän satotason siemenissä, kuin suuremman satotason siemenissä, (P<0,001; 365 vs. 339 g/kg ka). Raakavalkuaispitoisuus camelinan siemenellä oli 267–303 g/kg ka ja hampun siemenellä 275–277 g/kg ka, satotaso ei vaikuttanut hampun raakavalkuaispitoisuuteen (P>0,10). Tuhkapitoisuus oli camelinalla 33,7-40,5 g/kg ka ja hampun siemenellä 56,8-59,3 g/kg ka, satotaso vaikutti suuntaa antavasti hampun tuhkapitoisuuteen (P<0,10) ollen korkeampi pienemmän satotason siemenissä verrattuna suuremman sadon siemeniin (59,3 vs. 56,8 g/kg ka). Camelinan siementen glukosinolaattipitoisuudet olivat 15,7–26,3 mmol/kg ka ja trypsiini-inhibiittoriaktiivisuus (TIA) 15,0- 22,2 mg ka. Hamppunäytteiden TIA-pitoisuudet olivat suuntaa-antavasti korkeammat suuremman sadon siemenissä verrattuna pienemmän sadon siemeniin (P<0,10; 4,29 vs. 4,07 TIA/ mg ka). Tulosten perusteella camelinan ja hampun siementen koostumuksessa esiintyy vaihtelua, johon hampun osalta vaikuttaa satotaso. Hampun satotasoon voidaan vaikuttaa viljelykäytännöin. Camelina ja hamppu soveltuvat siemenen koostumuksen, glukosinolaattipitoisuuden ja trypsiini inhibiittoriaktiivisuuden perusteella täydennysvalkuaisrehuna osaksi kotieläinten ruokintaa